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大头蛙(Limnonects kuhlii)皮肤中抗菌肽的分离纯化、分子克隆及功能研究

王国祥  
【摘要】:抗菌肽是上世纪八十年代发现的一种小分子蛋白类物质,由于它不同于抗生素的独特的杀菌机制,使细菌很难对它产生耐药性,以及抗菌谱广、具有超强的杀灭效果,快速的杀灭速度,因此抗菌肽被认为是潜在的在临床上能替代抗生素来治疗细菌感染的药物。在本文中,通过两步纯化(Sephadex G-50分子筛和反相高压液相RP-HPLC)从大头蛙(Limnonectes Kuhlii)的皮肤分泌物中分离纯化得到五种新的抗菌肽并通过质谱鉴定与edman测序,分别与抗菌肽家族temporin, rugosin和gaegurin的结构类似,所以命名为temporin-LK1, rugosin-LK1, rugosin-LK2,gaegurin-LK1和gaegurin-LK2。同时从大头蛙的皮肤cDNA文库中筛选到9条编码抗菌肽的前体序列,其中有5条前体序列与前面的结果相符合。这些前体序列分别由65,70或75个氨基酸组成,都由保守的22个氨基酸的信号肽,前导肽(多含天冬氨酸和谷氨酸),以及成熟抗菌肽组成。最小抑菌浓度实验显示纯化得到的五种新的抗菌肽对检测的细菌、真菌以及部分耐药菌具有很强的杀灭活性。同时对抗菌肽家族rugosin和gaegurin前体序列的同义突变率和错义突变率进行分析,发现它们可能经受不同的选择压力。而且与黑带蛙来源的抗菌肽的二级结构比对和分析,说明两种不同来源抗菌肽的抗菌谱差异可能与其两亲性结构有关。大头蛙广泛分布在泰国、马来西亚、越南、中国云南等地,而关于蛙科大头蛙属抗菌肽的研究报导很少。从大头蛙皮肤分泌液中分离到与蛙科蛙属结构类似的抗菌肽家族temporin, rugosin和gaegurin,表明两栖动物大头蛙属与蛙属具有相同的抗菌肽家族。而且分离到的temporin-LK1(17个氨基酸,包括4个苯丙氨酸)与temporin家族其他抗菌肽(16个氨基酸,1到2个苯丙氨酸)有显著不同,为设计新型的抗菌肽提供了新的模板和用的参考资料。


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