多聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP-1)及其相关信号通路参与猪卵泡发育及闭锁的机制研究

【摘要】：对于哺乳动物,卵巢中仅有少数卵泡能够发育至成熟排卵,绝大多数卵泡的命运是卵泡闭锁(follicular atresia).事实上,卵泡从早期发育直到排卵的整个过程都有卵泡闭锁,普遍认为卵泡闭锁对于维持卵巢环境的稳定具有重要意义。然而,关于卵泡早期发育以及闭锁的调控方面虽然已有很多报道,但仍存在许多不明之处。为了研究猪卵母细胞巢的裂解、原始卵泡的形成和发育特征,我们根据本实验室之前的研究结果,选取胎儿期90(日龄)、新生1日龄及出生后25、70和150(日龄)5个阶段猪的卵巢组织样,应用苏木素-伊红染色(HE)方法进行组织学研究。结果表明,母猪在胚胎90日龄时卵巢中的生殖细胞主要以卵母细胞巢(oocyte nest)结构存在,这时的卵母细胞巢正在裂解并形成原始卵泡；母猪在新生1日龄时卵巢中的生殖细胞主要以原始卵泡存在,这时在卵巢皮质部位仍见卵母细胞巢(oocyte nest)结构存在,新生1天已经有原始卵泡形成。根据HE结果统计出生前后各日龄阶段卵母细胞巢和各级卵泡的比例。总之,随着猪日龄的增大,卵母细胞巢逐渐裂解并形成原始卵泡,在胚胎90日龄到新生1日龄是猪卵母细胞巢裂解和原始卵泡形成的关键时期,新生1日龄时猪卵巢中开始形成初级卵泡,说明原始卵泡的启动募集在新生第一天已经开始启动,到25日龄、70日龄时随着母猪日龄的增加卵母细胞巢逐渐较少,原始卵泡和初级卵泡逐渐增多,说明原始卵泡从新生1日龄左右到70日龄开始募集生长,这可为研究猪卵泡的启动募集提供参考依据。即便是在动物体内,细胞依然能够受到各种应激的影响,这种影响的最坏结果便是DNA链的损伤和断裂。研究发现,细胞内DNA损伤后相关蛋白会迅速会发生多聚ADP-核糖基化。多聚ADP-核糖基化是一种蛋白质翻译后修饰作用,受多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)调控,在DNA修复及细胞死亡等进程中起至关重要的作用。最近的研究发现PARP-1参与多种生理与病理过程,但是它在卵泡发育及闭锁过程中的作用仍未完全阐明。本研究旨在探讨PARP-1,解离的PARP-1, caspase-3及解离的caspase-3在胎儿,新生儿和成年猪卵巢细胞中的表达模式和免疫定位。本次试验研究表明,在胎儿猪和新生猪中,PARP-1解离参与卵母细胞巢破裂,原始卵泡形成以及转变为初级卵泡。免疫组化结果显示PARP-1解离参与卵泡发育和闭锁过程,这与我们之前的研究一致；然而,值得注意的是,解离的caspase-3主要定位于凋亡颗粒细胞的细胞核以及核周围,而解离的PARP-1主要定位于凋亡颗粒细胞的细胞核中。放射免疫法(R工A)的数据表明,出生后,血清中孕酮(P4)和雌二醇(E2)的浓度随着年龄的增长而增加。综上所述,本试验的研究结果表明,PARP-1信号通路参与胎儿猪和新生猪卵巢中卵母细胞巢破裂和原始卵泡形成,但其机制与成年猪卵巢中细胞凋亡引发的卵泡闭锁不同。有关PARP-1解离在猪卵泡中的作用仍需要进一步的研究。在畜牧生产或医学上,雌性哺乳动物的卵泡在正常情况下或受到应激的情况下卵泡都可能走向闭锁。卵巢卵泡闭锁是脊椎动物的一种常见现象,卵泡闭锁主要由颗粒细胞凋亡所引起,但其具体机制仍不清楚。PARP-1是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)家族的主要成员,尽管PARP-1的解离参与多种生理和病理过程,但其参与卵泡闭锁的作用机制未见报道,我们从体内和体外两个方面证实了PARP-1的解离参与了猪卵泡闭锁的过程。本研究结合雌二醇(E2)、孕激素(P4)的浓度以及P4/E2(P/E)比值和卵泡形态特征来确定卵泡健康状态,将卵泡分为将健康(H),早期闭锁(EA)和晚期闭锁(PA)三个阶段。免疫组织化学(IHC)结果表明,解离的PARP-1主要定位于闭锁卵泡凋亡颗粒细胞的核中；而PARP-1弄口caspase-3主要定位于健康卵泡(H)的颗粒细胞中；免疫印迹(WB)的结果表明,与健康卵泡(H)相比,闭锁卵泡(EA、PA)中PARP-1的表达显着下降,而解离的caspase-3 (17 kDa)表达量显着增加,同时,与健康卵泡(H)相比,闭锁卵泡(EA, PA)中解离的PARP-1 (24 kDa)显著增加,这证实了caspase-3的活化参与了卵泡闭锁过程。为了进一步证实颗粒细胞凋亡在卵泡闭锁过程中的作用,我们通过无血清培养建立了猪颗粒细胞凋亡模型。在凋亡的颗粒细胞中,PARP-1的表达显著降低,而解离的PARP-1 (24 kDa)和解离的caspase-3 (17 kDa)显著增加,这与体内研究结果具有一致性,同时表明caspase-3在缺少营养物质的条件下被激活。总之,激活的caspase-3导致PARP-1解离,且上述过程引起了颗粒细胞的凋亡；PARP-1可能通过其解离过程参与调控猪卵泡的闭锁,由caspase-3引起的PARP-1的解离可能是调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的分子机制,因此,我们的发现有助于解释和探究卵泡发育及闭锁的调控机制,并可能为猪育种过程中提高母猪繁殖力及抗病育种提供有价值的线索和依据。与PARP-1 -一样,去乙酰化酶Sirtuins也是NAD+依赖性酶,越来越多的研究显示这两种酶之间在发挥其各自的酶活性是对NAD+库的利用存在着竞争,而细胞内的NAD+库是有限的,因此在研究PARP-1作用时,有必要研究Sirtuins的变化。Sirtuins家族中的SIRT-1 (The Silent Information Regulator 1)和SIRT-2(The Silent Information Regulator 2)是组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase, HDAC)第三类成员,属于去乙酰化酶Sirtuins家族成员,广泛存在于动物细胞中,在基因沉默、细胞周期调节、脂肪酸代谢等诸多细胞活动中发挥作用；研究发现SIRT-1和SIRT-2在细胞凋亡中发挥重要的调控作用,然而对于他们在卵泡发育及闭锁过程中的作用机制还不清楚。本研究旨在探讨SIRT-1和SIRT-2在胎儿,新生儿乖成年猪卵巢细胞中的表达模式和免疫化学定位。本试验研究表明,在胎儿猪和新生猪中,SIRT-1和SIRT-2可能参与卵母细胞巢破裂和原始卵泡形成以及转变为初级卵泡过程。免疫组化结果显示SIRT-1和SIRT-2在卵泡发育和闭锁过程中的表达与定位呈现一定的特征,这说明SIRT-1和SIRT-2可能参与了卵泡发育及闭锁过程。然而,有关SIRT-1和SIRT-2在卵母细胞巢裂解、原始卵泡形成和发育以及卵泡闭锁过程中的作用机制尚待进一步的研究。细胞内的许多蛋白能够受到乙酰化和去乙酰化修饰,从而改变相关蛋白的活性特征,上面已经提到去乙酰化酶Sirtuins,目前研究较多的乙酰化酶闭锁是CBP/p300. CREB (CREB binding protein)结合蛋白CBP/p300共激活转录因子家族是由两个密切相关的转录共激活蛋白(或共激活因子)组成,广泛存在于动物细胞中,在基因沉默、细胞周期调节、脂肪酸代谢等诸多细胞活动中发挥作用；研究发现CBP/p300在细胞凋亡中发挥重要的调控作用,然而对于它们在卵泡发育及闭锁过程中的作用机制还不清楚。本研究旨在探讨CBP/p300在胎儿,新生儿和成年猪卵巢细胞中的表达模式和免疫定位。本次试验研究表明,在胎儿猪和新生猪中,CBP/p300可能参与卵母细胞巢破裂和原始卵泡形成以及转变为初级卵泡过程。免疫组化结果显示CBP/p300在卵泡发育和闭锁过程中的表达与定位呈现一定的特征,这说明CBP/p300可能参与了卵泡发育及闭锁过程。然而,有关CBP/p300在卵母细胞巢裂解、原始卵泡形成和发育以及卵泡闭锁过程中的作用机制尚待进一步的研究。研究发现,乙酰化酶CBP/p300能够对组蛋白H3 (histone H3)乙酰化修饰,而Sirtuins家族中的SIRT-1和SIRT-2都能够对其进行去乙酰化修饰；值得注意的是,这两种修饰之间存在着动态平衡,组蛋白在乙酰基转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)的作用下保持着动态平衡,研究证明组蛋白的乙酰化或去乙酰化修饰能够影响到染色质的转录活性状态。一般来说,组蛋白的乙酰化促进转录,而去乙酰化则抑制转录。Histone H3是在真核细胞中的染色质结构中的五个主要组蛋白之一。HistoneH3的修饰包括乙酰化与去乙酰化,它们分别是由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和去乙酰化转移酶(HDACs)所催化；已有的研究发现Histone H3在细胞凋亡中发挥重要的调控作用,然而对于他们在卵泡发育及闭锁过程中的作用机制还不清楚。本研究旨在探讨Histone H3和乙酰化的Histone H3蛋白在胎儿,新生儿和成年猪卵巢细胞中的表达模式和免疫定位。本研究表明,在胎儿猪和新生猪中,Histone H3的乙酰化可能参与卵母细胞巢破裂和原始卵泡形成以及转变为初级卵泡过程。免疫组化结果显示HistoneH3和乙酰化的Histone H3在卵泡发育和闭锁过程中的表达与定位各自呈现一定的特征,这说明Histone H3的乙酰化修饰可能参与了卵母细胞巢裂解、卵泡发育及闭锁过程。然而,有关Histone H3及其乙酰化修饰在卵母细胞巢裂解、原始卵泡形成和发育以及卵泡闭锁过程中的作用机制尚待更深入的研究。