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灰飞虱NADPH-细胞色素P450还原酶基因克隆及RNAi功能分析

王亚明  
【摘要】:灰飞虱Laodelphax striatellus (Fallen)是水稻和小麦等农作物上的一种重要害虫,它的危害方式分为两种:一是通过刺吸方式取食作物,造成组织损伤; 二是携带病毒至水稻、小麦等作物上引发病毒病。21世纪之前灰飞虱在我国几乎没有发生,未引起农业生产者的足够重视,只是在防治褐飞虱(Nilaparvata lugens)与白背飞虱(Sogatella furcifera)的过程中对其进行协同兼治。近年来,灰飞虱在我国大部分稻区特别是江苏、安徽等地频繁暴发。面对其大面积发生,人们主要通过化学药剂进行防治。但由于农药的不合理使用,灰飞虱抗性得到不断上升,灰飞虱频繁大发生与其抗药性的升高紧密相关。鉴于农药使用导致田间抗性水平不断提高,以及过量使用农药带来的一系列环境与社会问题,开辟害虫防控新途径是当今植物保护领域迫在眉睫的一项科研任务。鉴于此,本文首先克隆分析潜在的靶标基因,探索目标基因的沉默是否导致灰飞虱死亡,从而挖掘重要的靶标基因,为利用现代生物学技术防控灰飞虱提供重要的基因材料和方法启示,为更好地进行灰飞虱抗性治理和新药开发提供新的依据。一、灰飞虱NADPH-细胞色素P450还原酶基因全长克隆及序列分析首先通过简并引物获得灰飞虱NADPH-细胞色素P450还原酶(LSCPR) 1550bp的基因片段,然后通过RACE技术成功获得LSCPR基因全长。基因编码区全长2040bp共编码679个氨基酸,氨基酸比对发现LSCPR与其它已报道昆虫有较高的同源相似性,序列比对显示与褐飞虱(N. lugens) CPR有94%同源性、与温带臭虫(Cimex lectularius) CPR有75%同源性、与弓背蚁(Camponotus cylindricus) CPR有70%同源性,并且包含CPR基因所有的保守序列特征,其中主要包括膜锚定区(E15-W35)、黄素氧还蛋白区(81A-218W)、FAD结合区(273P-492W)、NADP结合区(531I-643N)、 FAD结合核心保守位点(453-RYYS-456)、标准催化残基(456S、631C、676D和678W)、 FMN1结合位点和FMN2结合位点。因此初步推断该基因为LSCPR基因。二、灰飞虱NADPH.细胞色素P450还原酶基因RNAi功能分析以灰飞虱NADPH-细胞色素P450还原酶(LSCPR)基因为靶标,通过T7 RiboMax Express RNAi System成功合成LSCPR双链(338bp),以外源荧光蛋白基因(GFP)为对照,分别采用不加任何双链的人工食料和浓度为500ng/uL的LSCPR和GFP双链喂食灰飞虱一龄若虫来实现LSCPR基因沉默。连续喂食5d后,通过实时定量PCR检测RNAi后的LSCPR表达量,结果显示:与对照相比,LSCPR基因表达量显著上升(上升50%左右)。此外,与对照相比,灰飞虱发育历期也表现一定迟缓及死亡率升高现象。这些研究初步表明LSCPR对昆虫发育起到非常重要的作用,但RNAi干扰后基因表达量上升机制还需进一步研究。


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