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普通小麦感赤霉病突变体的鉴定和望水白及其感病突变体受赤霉病菌诱导的基因差异表达分析

肖进  
【摘要】:小麦赤霉病是一种主要由禾谷镰刀菌引起的世界性流行病害,该病广泛发生在世界温暖潮湿和半潮湿地区,严重危害小麦产量、品质和粮食安全生产。选育抗赤霉病小麦品种是控制麦类赤霉病最经济、环保和有效的途径。中国是世界上开展小麦抗赤霉病研究最早的国家之一。自20世纪50年代开始,国内外学者就针对小麦赤霉病病原菌的致病菌种、致病性、致病机理及抗源筛选、抗性鉴定技术、抗赤霉病性遗传、抗病基因定位、抗性生理生化机制、抗性育种等方面做了大量研究,并取得了较为显著的进展,然而有关小麦抗赤霉病相关基因克隆的研究报道很少,对小麦抗赤霉病的分子机制更是缺乏全面系统的理解和认识。突变体是功能基因组学研究的重要材料,创造感霉病突变体,对于研究抗病机理和克隆抗病基因具有重要意义。小麦品种苏麦3号和望水白是两个最重要的小麦种内赤霉病抗源,本研究利用快中子辐照苏麦3号和望水白成熟干种子,在后代中筛选出多个感赤霉病的突变体,比较了望水白感赤霉病突变体NAUH117在形态、病源菌侵染过程、基因表达的差异,对突变体感病性进行遗传分析,并在突变体NAUH117的染色体缺失区段上克隆了1个受体蛋白激酶基因。本研究的主要研究结果如下:1.苏麦3号和望水白感赤霉病突变体的获得和鉴定苏麦3号和望水白是高抗赤霉病的小麦品种,其抗性是由核内多基因控制的复杂数量性状,本研究通过快中子辐照苏麦3号和望水白成熟干种子,在后代中获得了多个突变体,从M5代到M8连续四年应用小穗单花滴注接种和一年应用孢子液喷雾接种对突变体进行赤霉病抗性鉴定,鉴定了8个赤霉病抗性相对各自野生型对照有显著性降低的感赤霉病突变体。利用已报道的与17个抗赤霉病QTLs连锁的分子标记对这8个突变体进行分析,有4个突变体在3BS发生缺失,有1个突变体在5DS发生缺失,另外3个突变体突变位点与上述5个突变体不同,还需要进一步鉴定。2.望水白感赤霉病突变体NAUH117表型、分子标记鉴定和感病位点遗传分析1)望水白及其感赤霉病突变体NAUH117赤霉菌侵染过程比较:以GFP标记赤霉菌Chi-2侵染小麦穗部,在荧光体式镜下通过观察绿色荧光信号分布来监视赤霉菌动态侵染过程。比较赤霉菌侵染望水白和NAUH117过程发现,赤霉菌可以通过小穗轴基部侵入到NAUH1176勺穗轴,并在穗轴中扩展,感染临近小花或小穗;而赤霉菌不能或很难透过望水白小穗轴基部进入穗轴内部。2) NAUH1176勺感病位点的分子标记鉴定:利用定位于除3BS以外的其他染色体上的796个SSR、STS等分子标记和定位于3BS上的86个SSR、STS和ISBP标记在望水白和NAUH117司扩增,结果表明,只有定位于3BS上的部分标记在两个材料间有差异扩增,其他标记均未扩增出差异条带。对3BS上的分子标记扩增结果进一步分析表明,位于3BS染色体区段FL0.57-1之间的标记都不能在NAUH117中扩增出3B特异条带,而本研究所用的位于3BS FLO.56-0.57之间的4个标记中,有两个可以扩增出3B特异条带,有两个不能扩增出3B特异条带,表明NAUH117在3BS上存在染色体区段的缺失,缺失断点位于3BS FL0.56-0.57区间,由于前人定位的3BS上的QTL位于FL0.78-0.87,推测由于该QTL的缺失是NAUH117感病的主要原因。3)NAUH117感病位点的遗传分析:配置了望水白和NAUH117杂交组合,抗性鉴定结果表明,正反交Fl所有单株的赤霉病抗性水平都与望水白相同,F2群体出现抗感分离,在436个F2株群体发现102个感病单株,χ2测验表明抗感分离比例符合3:1,表明NAUH117感病是核内单基因控制的隐性突变;对F2群体的分子标记分析进一步证实,NAUH117感病根本原因在于3BS上已经定位的一个抗FHB主效QTL发生了缺失。3.应用基因芯片技术分析赤霉菌侵染望水白和NAUH117基因表达谱差异利用Affymetrix小麦基因表达谱芯片分别分析了望水白和NAUH117接种赤霉菌相对于接种水对照的基因表达变化,筛选出望水白和NAUH117受赤霉病诱导的上调和下调差异表达基因。选择7个在望水白中受赤霉菌诱导上调表达的探针序列设计引物进行半定量RT-PCR验证,结果与芯片结果一致,表明芯片结果可靠。受赤霉菌诱导的差异表达基因在望水白和NAUH117中有的是共同的,有的是各自特有的。相对于NAUH117,望水白中特异差异表达基因、特别是特异上调表达基因在抗病中发挥重要作用,这些基因包括信号接收和传导相关基因、与细胞衰老凋亡有关基因、病程相关蛋白基因和转运相关蛋白或蛋白酶基因等;而望水白和NAUH117共同上调表达基因涉及了乙烯通路、茉莉酸信号通路、苯丙烷代谢等通路中的多个基因,推测这些抗病通路参与了抗赤霉病反应;NAUH117中也有一些特有的上调表达的基因,它们可能与3BS上QTL以外的其它望水白抗赤霉病QTL的抗病通路有关。4.望水白3BS抗赤霉病主效QTL Fhbl附近一个受体蛋白激酶基因的克隆根据芯片杂交结果,结合望水白3BS抗赤霉病主效QTL区域与短柄草的比较基因组分析,本研究选择一个在望水白中受赤霉菌诱导上调表达的探针设计引物,利用RACE技术在望水白中克隆了1个受体蛋白激酶基因,该基因全长1843bp,编码380个氨基酸,经SMART软分析,该基因编码了一种跨膜蛋白,在N端具有22氨基酸信号肽序列,并且包含由约80个氨基酸组成的未知功能胞外区,中央位置是由28个氨基酸组成的疏水跨膜区域;C端包括一个由211个氨基酸组成丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶(S/TPK)胞内域,具有这种蛋白结构的基因为受体类蛋白激酶(receptor-like Kinase, RLKs),将该基因暂时命名为TaNRLK-B。利用缺体-四体和缺失系将该基因定位于小麦3BS FL0.78-0.87区域,即望水白Thb1所在区域。半定量RT-PCR和Q-PCR均表明,TaNRLK-B受赤霉菌诱导在望水白中上调表达。但由于该基因在NAUH117中缺失,因此在NAUH117中利用RT-PCR未检测到其表达。本研究分别构建了该基因超量表达载体和RNAi干扰载体,并分别利用茎尖转化和基因枪转化法转化小麦,转基因植株的再生、鉴定正在进行之中。


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