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三种茄科作物Pht1家族磷转运蛋白基因的克隆及表达调控分析

陈爱群  
【摘要】:磷(P)是植物生长发育必需的大量营养元素之一,广泛参与植物体内的生化合成、能量转移、信号转导等代谢过程。磷在土壤中主要以无机磷酸盐(Pi)的形态被植物吸收利用。由于磷在土壤中容易被固定,使其成为世界范围内有效性最差的营养元素之一。植物在长期的进化中已经形成了对磷缺乏的适应性机制,包括改变根系形态结构、改善根际土壤的化学性质、与土壤中的菌根(Mycorrhiza)真菌形成共生体系、诱导高亲和磷转运蛋白(PT)的表达等。植物通过在根系细胞膜上表达多种不同亲和力的磷转运蛋白来吸收和转运土壤中的有效磷。迄今为止,大多数被分离和鉴定的磷转运蛋白都属于高亲和的Phtl家族。茄科作物(Solanaceous species)是仅次于禾本科和豆科作物的世界第三大经济作物。尽管在番茄(Lycopersicon esculentum)和土豆(Solanum tuberosum)中已经相继克隆到了多个Phtl家族的磷转运蛋白基因,但是对它们的功能特别是表达调控方面的研究还十分有限。为了进一步了解茄科作物Phtl基因家族的时空表达模式以及对磷素和菌根的响应机制,本研究从茄科作物辣椒(Capsicum frutescens)、茄子(Solanum melongena)和烟草(Nicotiana tabacum)中各克隆了5个属于Phtl家族的磷转运蛋白基因,并在茄子和烟草中分离到了其中3个基因的启动子。通过RT-PCR、启动子融合GUS报告基因表达、启动子缺失以及酵母单杂交等方法分析茄科作物Phtl家族磷转运蛋白在磷素吸收转运方面的功能以及可能存在的的调控机制。所获主要结果如下:1.根据其它作物中已报道的Phtl家族的磷转运蛋白基因的保守区设计简并引物,通过PCR方法从茄科作物辣椒、茄子和烟草中各分离到了5个可能属于Phil基因家族的片段序列,进一步通过IiLM-RACE方法,获得了这些基因的全长cDNA序列。2.氨基酸序列比对结果显示这些Pht1基因在结构和功能性位点上具有高度的保守性。进化树分析发现,这些基因之间具有很高的共生同源性和直系同源性,在进化关系可以大致分为三个亚家族的五类同源基因,(Phtl;1 Phtl;3)、Phtl;2、(Phtl;4 Pht1;5)。Southe rn杂交显示Pht1;5在辣椒、茄子和烟草的基因组中均为单拷贝基因。3.采用半定量RT-PCR和Real-Time定量PCR法检测Pht1基因在辣椒、茄子和烟草中的表达模式,结果表明Pht1在辣椒、茄子和烟草中具有相似的表达模式:Pht1;1和Pht1;2的表达量受磷饥饿诱导上调,Pht1;1在叶片和根系中均有表达,但在根系中表达要强于叶片;Pht1;2只在根系中有表达;Pht1;3受菌根诱导增强表达,Pht1;4和Pht1;5为菌根特异性诱导表达。值得一提的是有别于其他茄科植物的Pht1;4和Pht1;5基因,茄子的Pht1;4和Pht1;5基因在极度缺磷的条件下在根系强烈诱导表达。在低磷供应的条件下,Pht1;1和Pht1;2在辣椒、茄子和烟草的菌根植株中的表达量有所下调。4.根据Phtl基因编码区的已知序列,利用反向PCR的技术,从茄子和烟草的基因组中分离了Pht1;3、Pht1;4和Pht1;5的启动子,序列分析发现这些启动子中的转录起始位点距离翻译起始位点ATG都很近,且在转录起始位点上游-25~-30bp处都存在着TATA-box,符合真核生物转录起始位点的位置特征,但是在上游-70~-80bp处都没有CAAT-box保守基序存在。5.将Pht1;3、Pht1;4和Pht1;5启动子定向替换植物双元表达载体pB1121中的35S启动子,将其与GUS报告基因融合,通过农杆菌介导转化烟草。研究发现所分离的全部6个菌根调控的Pht1基因的启动子片段都可以驱动GUS报告基因在烟草的菌根中特异性表达,而在其它组织以及没有被菌根菌侵染的烟草中都不表达。对GUS进一步的组织化学定位分析显示,Pht1;3,Pht1;4和Pht1;5启动子主要驱动GUS基因在菌根含有丛枝和类丛枝(缠绕的菌丝)的皮层细胞中特异性表达。因此推测在这些基因的启动子中可能存在着相同的、与菌根特异性诱导转录因子相结合的顺式调控元件。6.序列分析显示所分离到的Pht1;3、Pht1;4和Pht1;5基因的启动子在各自的直系同源基因(orthologous genes)之间分别存在着较为保守的区域,但是在共生同源基因(paralogous genes)之间的保守性很差。Place数据库程序分析发现,在全部6个菌根调控的Phtl基因的启动子中不仅都存在P1BS(GNATATNC)和root motif box(ATATT)等一些已知的与磷诱导以及根系表达有关的顺式作用元件外,而且在部分启动子序列中还存在调控豆科作物豆血红蛋白基因在根瘤和菌根组织特异性表达相关的顺式作用元件NODCON2GM(CTCTT)和OSE1ROOTNODULE(AAAGAT)。其中P1BS除了在SmPT5启动子中存在两个拷贝,在其它5个Pht1基因的启动子中均只含有1个拷贝,且都位于转录起始位点上游-200 bp以内。此外,在全部6个菌根调控基因的启动子中都存在着一个尚未报道的新基序TTTCTTGT,而该基序在不直接受菌根调控的其他Phtl家族基因的启动子中不存在,因此将之命名为Myc-box,该基序在茄子和烟草的Pht1;4的启动子中都存在着两个拷贝。7.根据Pht1;3、Pht1;4和Pht1;5启动子序列特征,利用PCR技术分别对启动子进行了外部缺失和内部缺失处理。根据所缺失处理的Pht1基因启动子与GUS报告基因融合转基因烟草的GUS表达分析,结合顺式调控元件(cis-elements)的分析结果,推测至少需要P1BS和Myc-box两个基序协同调控菌根诱导条件下的Pht1基因的表达,缺少其中的任何一个都会导致表达强度的大幅减弱,甚至消失。对目前已报道的受菌根诱导表达的Pht1基因的启动子序列分析发现,在所有双子叶植物受菌根诱导的Pht1基因的启动子中都同时含有P1BS和Myc-box这两个元件,而单子叶作物水稻的OsPT11中只有P1BS元件存在,而不含有Myc-box元件。8.通过培育G. intraradices (菌根真菌种)侵染烟草的根系构建了烟草的菌根cDNA文库,利用酵母单杂交技术在该文库中分离到了一个可能和Myc-box序结合的烟草蛋白因子,相应的cDNA包括765bp的编码区,编码255个氨基酸的多肽,分子量约为29KD。同源序列比较发现,该基因可能编码一个功能未知的蛋白,与烟草中已报道的Harpin蛋白诱导基因hin18具有最高的同源性,氨基酸序列的一致性为22.3%,因此将之命名为NtHRL (Harpin Responsive Like).生物信息学预测该基因可能为核定位,Bioedit软件分析NtHRL只有一个跨膜结构,在PDB的数据库中没有找到与之类似的蛋白质三级结构模型。对于该基因究竟是不是茄科植物的菌根转录因子还需要进一步的实验去证明。ISOLATION AND ANALYSIS OF EXPRESSIONAL REGULATION OF PHOSPHATE TRANSPORTER GENES IN PHT1 FAMILY FROM THREE SOLANACEOUS SPECIES


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