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棉花两个MYB基因的克隆及功能验证

高兴  
【摘要】:棉纤维发育是一个复杂的生物学过程,MYB转录因子在其中可能起着重要的调控作用。本实验室曾以陆地棉徐州142(Xu142)、苏研401、7235和CJ139以及徐州142无纤维突变体(fl)为材料,比较了开花当天和开花后1 day post anthesis (DPA)胚珠的基因表达谱差异,其中有两个MYB基因在所有正常棉花纤维中大量表达,而在fl中显著下调表达,推测它们可能在纤维发育过程中起着重要作用。本研究从陆地棉徐州142中克隆到了这两个MYB基因,并对其功能进行了初步研究。具体结果如下:1.采用RACE技术克隆了这两个MYB基因的cDNA全长,其中一个MYB蛋白质序列与拟南芥AtMYB60相似度为58%,故将其暂命名为GhMYB60。GhMYB60 cDNA全长共1052bp,共编码297个氨基酸。亚细胞定位显示GhMYB60蛋白定位于细胞核内,这说明该基因是一个在核内起转录调控作用的转录因子。采用exonerate软件分析结果显示GhMYB60位于D亚组第13条染色体上,其基因组序列中包含2个内含子结构。2.另一个MYB蛋白分别与棉花GhMYB25及GhMYB25-like相似度为81%及62%,故将其暂命名为GhMYB25-1。GhMYB25-1 cDNA全长共1226bp,共编码332个氨基酸。亚细胞定位显示GhMYB25-1蛋白定位于细胞核内,这说明该基因也是一个在核内起转录调控作用的转录因子。采用exonerate软件分析结果显示GhMYB25-1位于D亚组第13条染色体上,其基因组序列中包含2个内含子结构,同时GhMYB25及GhMYB25-like则分别位于D亚组第12及第8条染色体上,这表明GhMYB25-1虽然与GhMYB25及GhMYB25-like相似性较高,但其在棉花中并未被克隆过,是一个新的基因。3.采用qRT-PCR技术,对GhMYB60和GhMYB25-1在Xu142和fl的时空表达特征进行了分析。结果表明:GhMYB60在Xu142以及fl的根、茎、叶、-3 DPA、0 DPA和3 DPA的胚珠,Xu142的6 DPA、10DPA、15 DPA和20 DPA的纤维以及fl的6 DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的胚珠中都有表达,其中在Xu142的叶片、0 DPA及3 DPA的胚珠中显著高表达于fl;从6 DPA开始,在Xu142的纤维中GhMYB60都处于一个较高的表达水平,但其表达量一直下降,而在fl的胚珠中,该基因表达量持续上升。这说明GhMYB60可能在棉花纤维发育过程中起作用。4.除了在野生型棉花Xul42的0 DPA胚珠中显著高表达于fl之外,GhMYB25-1在Xu142以及fl的根、茎、叶、-3 DPA、0 DPA和3 DPA的胚珠,Xu142的6 DPA、10DPA、15 DPA和20 DPA的纤维以及fl的6DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的胚珠中的表达量并无明显差异,从3 DPA开始,无论是在野生型Xu142还是fl突变体中,该基因的表达水平一直上升,直到15 DPA趋于平稳,并且其表达量都处于一个较高水平。这一结果表明GhMYB25-1有可能在纤维突起形成过程中起着重要的作用。5.分别构建GhMYB60及GhMYB25-1基因的植物过表达载体,通过泡花法将它们导入到Col-0型拟南芥中,并成功获得了转基因拟南芥阳性苗。通过观察GhMYB60转基因T1、T2代拟南芥表型,以及部分功能性实验发现,GhMYB60促进根系发育,使得转基因拟南芥的初花期提前大约两周左右,此外植物激素脱落酸(ABA)、生长素(IAA)以及甘露醇可以促进GhMYB60基因表达,从而影响种子萌发和根系发育。因此,GhMYB60基因可以感受逆境信号,通过促进根部生长提高植物对逆境的抗性。6.构建了3个不同启动子启动的GhMYB60重组植物过表达载体,采用农杆菌介导的方法转化棉花,胚性愈伤GUS活性检测显示GhMYB60已经成功导入,目前已经得到了再生植株,为进一步研究该基因在棉花生长发育中的功能奠定了基础。


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