牛膝多糖脂质体的免疫增强活性研究

【摘要】：牛膝,别名叫牛磕膝,其属于苋科、牛膝属。牛膝拥有滋补肝肾、散化恶血、破症结、减缓腰膝酸疼功能。该论文研究的牛膝多糖(Achyranthesbidentatapolysaccharides,ABPS),提取自怀牛膝,ABPS是一种可溶于水小分子生物活性多糖,能够提高机体的免疫力,抑制肿瘤生长及升高白细胞等。现今,牛膝多糖的化学构造也早已得到研究,由果糖和葡萄糖构成,糖基比8.7:1.0,有4～21个糖单位,1400的平均分子质量。与部分其他多糖比较,牛膝多糖具有分子量小、水溶性好、药源广泛且既可口服又可注射的特点,作为医药开发应用的前景更为广阔。脂质体(Lipsomes)是一种薄膜微球的药物缓释制剂,在脂质双分子层中包入药物。脂质体具有多项优点,例如,药物毒性减弱,提高药物的稳定性,减少过敏反应和免疫反应,延迟药物释放,改变药物的体内分布、药物靶向释放。将牛膝多糖包封于脂质体中,可提高牛膝多糖实际生产过程中和临床上的利用度,并且为临床使用提供一种可参考的剂型,同时也为后续的研究奠定基础。本论文中牛膝多糖脂质体(Achyranthesbidentatapolysaccharides liposome,ABPSL)的制备方法选用薄膜分散法,然后采用响应面法优化了牛膝多糖脂质体的最佳制备条件,并在体外研究了牛膝多糖脂质体的免疫增强活性。试验分为以下四个部分:试验Ⅰ牛膝多糖脂质体的制备及制备条件的优化本章经薄膜分散法和逆向蒸发法制备脂质体,并通过对比后,最终选用薄膜分散法制备ABPSL,而优选ABPSL制备的最佳条件采用响应曲面法。用微柱离心法来分离脂质体与未被包封的药物,然后用5%苯酚-浓硫酸比色法测定ABPS的浓度,从而通过以上数值来计算脂质体对药物的包封率。以包封率和载药量为指标,分别考察了脂药比、膜材比、磷脂-吐温80比和超声时间4个单因素,以优选牛膝多糖脂质体制备的最佳条件。在单因素试验的基础上,对影响包封率较大的三个因素,脂药比、磷脂-吐温80比和超声时间采用响应面法进行研究。将数据通过专门软件Design-Expert进行分析,从而得到结论,当脂药比为26:1,磷脂-吐温80比为6:1,超声时间为14min时,为制备牛膝多糖脂质体的最佳条件。根据最佳制备条件组合进行验证性试验,所得脂质体包封率为80.885±1.145%,与预测值79.90%的相对误差仅为1.23%。试验Ⅱ牛膝多糖脂质体体外对小鼠淋巴细胞增殖的影响首先对ABPSL和ABPS进行小鼠外周血淋巴细胞生长的最大安全浓度测定。ABPSL和ABPS由2mg·mL~(-1)为起始浓度倍比稀释至11个浓度,将其分别加入分离好的细胞中,体外培养48h后使用MTT法测定吸光值,并筛选出不显著低于细胞对照组的为最大安全浓度;ABPSL、ABPS和BL取最大安全浓度以下的5个浓度,单独或协同PHA,LPS加入小鼠外周血淋巴细胞中,外培养48 h后依然采用MTT法进行测定,观察ABPSL对脾淋巴细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖情况的影响。结果显示,ABPSL在7.813~15.625 ug·mL~(-1)浓度范围及浓度125ug·mL~(-1)时,相比ABPS,更能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖;ABPSL在15.625～62.5 ug·mL~(-1)浓度范围内,相比ABPS,协同LPS促进小鼠脾脏B淋巴细胞增殖的效果更显著;在7.813～125 ug·mL~(-1)浓度范围内除了31.25μg·mL~(-1)时,ABPSL相比ABPS,能更好地协同PHA促进小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖。试验Ⅲ牛膝多糖脂质体对小鼠T淋巴细胞亚群的影响本章试验研究小鼠T淋巴细胞亚群细胞在不同药物形态作用下的表达及比较分析。在制得的脾淋巴细胞悬液中加入一定浓度的ABPSL、ABPS和BL(31.25μg·mL~(-1))0.5mL,该浓度下重复三个孔,另设细胞对照孔,一定条件培养后加入CD3~+,CD4~+和CD8~+混合抗体进行标记,采用双染色标记法标记,然后用流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群CD4~+、CD8~+的含量变化。数据分析结果表明,ABPSL组T淋巴细胞亚群CD8~+细胞含量显著低于ABPS组和BL组,而ABPSL组T淋巴细胞亚群CD4~+细胞含量以及CD4~+/CD8~+的比例均显著高于ABPS组、BL组和BC组,表明其免疫效果优于ABPS和BL。综上可知ABPS经脂质体包封后,二者可协同作用以增强机体的免疫功能。试验Ⅳ牛膝多糖脂质体体外对巨噬细胞免疫功能的作用本章试验将就ABPSL对非特异性免疫力的影响做进一步的探究,通过ABPSL对小鼠腹腔巨噬细胞的作用,以研究ABPSL对巨噬细胞活性及免疫功能的影响。结果显示,ABPSL高浓度组刺激巨噬细胞分泌IL-1β含量显著高于其余各组,其次为LPS组和ABPSL中浓度;ABPSL高浓度组刺激巨噬细胞分泌IFN-γ含量最高,且显著高于其余各组,其次为ABPSL中浓度组;LPS组刺激巨噬细胞分泌TNF-α含量最高,均显著高于其他组,其次为ABPSL高浓度组。