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2-苯氧基苯甲酸(2-PBA)降解菌株的筛选、鉴定及对2-PBA和二苯醚的代谢机制研究

蔡舒  
【摘要】:二苯醚及其衍生化合物如苯氧基苯甲酸(PBA)、二苯醚类除草剂、杀虫剂和多卤代二苯醚在农业和化工行业中得到广泛应用,在保证农业生产、保障人们生活的同时,也导致严重的环境污染。大量研究表明二苯醚类合物污染严重危害生态环境及人类和其它生物健康。因此研究二苯醚类化合物的微生物降解过程和机制,开发二苯醚类污染微生物降解修复技术具有非常重要的理论意义和实际应用价值。微生物的代谢作用是环境中二苯醚类化合物降解的主要因素。目前国内外分离筛选到多株二苯醚类化合物降解菌株,发现了两条二苯醚类化合物降解代谢途径:侧面双加氧途径和角度双加氧途径,并克隆到多个降解基因。但是迄今为止,国内外尚未分离到能够降解重要的二苯醚类化合物2-PBA的菌株,对其微生物降解过程和机制还不清楚。本文筛选到两株能够降解2-PBA的Sphingobium属菌株SC_3和SC_4,通过多相分类研究,将菌株SC_3和SC_4鉴定为Sphingobium属新种。研究了SC_3对二苯醚和2-PBA降解代谢途径、降解基因和降解酶,发现了一条微生物降解二苯醚的新途径。主要研究结果如下:(一)二苯醚类化合物降解菌株的筛选、生物学特性和分类地位研究以2-PBA为唯一碳源,通过连续传代富集技术筛选到两株能够降解2-PBA的Sphingobium属菌株SC_3和SC_4。降解结果表明菌株SC_3和SC_4都能够完全降解2-PBA和二苯醚,并利用2-PBA和二苯醚为唯一碳源生长。根据16S rRNA基因同源性分析,发现菌株SC_3与Sphingobium属的同源性在95%-97.0%之间,与Sphingobium abikonense KCTC 2864T的同源性最高,同源性为97.0%;与其他Sphingobium菌属的同源性都低于97%。菌株SC_3与Sphingobium abikonense KCTC 2864T的DNA-DNA杂交率为36.8±4.7%。通过16S rRNA序列分析、生理生化特征、脂肪酸成分分析、细胞化学成分分析及DNA-DNA杂交等多相分类技术将菌株Sphingobium sp.SC_3鉴定为Sphingobium属的一个新种,根据其能降解2-PBA的特性命名为Sphingobium phenoxybenzoativorans sp.nov.。根据16S rRNA基因分析,发现菌株SC_4与Sphingobium属同源性最近,与Sphingobium phenoxybenzoativorans SC_3T同源性最高,同源性为97.08%。菌株SC_4和Sphingobium phenoxybenzoativorans SC_3T的DNA-DNA值为44.2±1.5%。通过多相分类研究分析将菌株Sphingobium sp.SC_4鉴定为Sphingobium属的一个新种,根据其能降解二苯醚的特性命名为Sphingobium diphenylethervorans sp.nov.。(二)菌株SC_3降解2-PBA和二苯醚的代谢途径菌株SC_3能降解二苯醚、2-PBA、2,3-二羟基苯甲酸、苯甲酸、苯酚和邻苯二酚,但不能降解2-PBA的同分异构体3-PBA和4-PBA。菌株SC_3降解2-PBA的最适条件为:温度30℃和pH值7.0。通过HPLC和LC-MS技术检测到菌株SC_3降解2-PBA和二苯醚的两个中间代谢产物:2,4-己二烯酸苯酚酯和苯酚。推测菌株SC_3降解2-PBA和二苯醚的代谢途径为:2-PBA或二苯醚在一个角度双加氧酶催化下在苯环上连接氧的角度碳原子C1及其邻位碳原子C2分别加氧后形成不稳定的半缩醛结构,随后半缩醛的C1-C2共价键自发开裂(同时2-PBA的羧基被脱去)导致苯环开环,生成2,4-己二烯酸苯酚酯。2,4-己二烯酸苯酚酯的酯键水解后生成苯酚和粘康酸半醛。这一途径与已报道的二苯醚侧面双加氧开环途径的开环过程和产物均不同。(三)降解2-PBA的角度双加氧酶基因的克隆和功能分析利用Illumina Hiseq2000技术测定了菌株SC_3的基因组。菌株SC_3基因组大小为5,044,557 bp,编码的ORF为4906个,G+C%含量为62.2%。基因克隆的策略是既然2-PBA跟二苯呋喃、咔唑、二苯并噻吩和二噁英的结构类似,降解2-PBA的角度双加氧酶基因序列也应该和降解上述物质的角度双加氧酶序列有一定的相似性。将11个已报道的角度双加氧酶与SC_3全基因组进行dot plot比对,从SC_3基因组发现9个疑似的双加氧酶基因,通过功能验证试验确证其中一个位于contig 0053上的双加氧酶基因为2-PBA和二苯醚降解基因,命名为dpeA1A2。系统发育分析表明DpeA1A2属于Type V类RHO氧化酶,DpeA1含有该类型α亚基所共有的[2Fe-2S]保守位点(CXH17CX2H),该位点中包含能与铁离子共价结合的两个His(119,140)和两个Cys(117,137)残基。另外,DpeA1还含有一个Fe(Ⅱ)保守位点[EX4DX2HX4H],包含能与铁离子共价结合的Asp(235)、Glu(230)和His(238,243)保守残基。通过同源重组单交换技术成功获得dpeA1基因被插入突变的突变株SC_3(QCA),突变株SC_3(QCA)失去了对2-PBA和二苯醚的降解能力,突变株回补dpeA1A2基因后恢复了降解2-PBA和二苯醚的能力,说明dpeA1A2是菌株SC_3中的唯一的降解2-PBA和二苯醚的双加氧基因。Real-time PCR实验结果表明2-PBA和二苯醚可诱导dpeA1A2的转录。(四)铁氧还蛋白基因dpeB和还原酶基因dpeC的克隆及Dpe全酶的体外活性研究通过将菌株SC_3基因组和已经报道的Type V类RHO氧化酶的铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶进行dot plot比对,在菌株SC_3基因组中发现了一个可能的[2Fe-2S]型铁氧还蛋白基因dpeB和一个GR型还原酶基因dpeC。dpeB编码了一个105个氨基酸的蛋白,dpeC编码了一个408个氨基酸的蛋白。通过pET29a表达系统成功表达并通过镍柱纯化了这个双加氧酶的四个组分DpeA1、DpeA2、DpeB和DpeC。将纯化的四个组分混合,成功重组了具有降解2-PBA和二苯醚活性的全酶DpeA1A2BC。HPLC和LC-MS鉴定结果表明DpeA1A2BC能够将2-PBA和二苯醚转化为2,4-己二烯酸苯酚酯。因此确定DpeB和DpeC能够为DpeA1A2传递电子。以上结果表明角度双加氧酶DpeA1A2BC催化的二苯醚双加氧开环方式是一种不同于已报道的二苯醚侧面双加氧方式,也不同于已报道的角度双加氧方式。在侧面双加氧方式中,需要双加氧酶BphA、脱氢酶BphB和双加氧酶BphC三个酶共同作用,经过C2和C3碳原子双加氧、脱氢和双加氧三步反应才能导致二苯醚其中一个苯环开环,而本文报道的双加氧酶Dpe在角度碳原子C1及邻近C2碳原子双加氧形成不稳定的半缩醛结构,半缩醛结构能够自发开环,因此只需一个酶一步反应就能够导致二苯醚的一个苯环开环。已报道的角度双加氧酶断裂的位置为双加氧形成的两个羟基的间位(外开环),即醚键断裂形成一个苯环;而本论文报道的角度双加氧酶开环的位置为双加氧形成的两个羟基中间的C-C键,即邻位开环(内开环)。


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