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黄瓜线粒体DNA父系遗传细胞学机理及相关调控机制研究

沈佳  
【摘要】:线粒体是真核生物细胞内重要的细胞器,具有自身DNA,并以非孟德尔遗传方式进行遗传。线粒体遗传研究对于物种的遗传多样性研究、作物遗传与品种改良等都具有非常重要的理论和实践意义。线粒体遗传是一个长期探索的科学问题。虽然线粒体非孟德尔遗传现象早已被人们普遍接受,但对其细胞学及分子调控机理知之甚少。在被子植物的研究中发现,雄性性细胞的发育阶段对线粒体DNA数量的调控被确定是线粒体DNA遗传调控的关键。在线粒体表现为母系遗传的植物中检测到了花粉特异性表达的核酸酶,参与了花粉内线粒体DNA的降解,阻碍了父系线粒体DNA进入受精卵,被认为有助于线粒体的母系遗传。而在线粒体父系遗传的植物中,花粉中线粒体DNA数量的变化及调节规律至今未知。本研究选用线粒体表现为父系遗传的黄瓜(Cucumis sativus L.)为试验材料,通过对不同发育时期的花粉进行细胞学观察、核酸酶基因CsDPD1的克隆以及转基因验证,围绕花粉中线粒体DNA在花粉发育过程中的分布和变化规律探讨黄瓜线粒体DNA父系遗传的机制,主要研究结果如下:1.黄瓜线粒体父系遗传细胞学机制的观察分析利用MTG/DAPI双染色方法结合电镜观察,发现花粉小孢子第一次有丝分裂时线粒体以及线粒体DNA随机分布于营养细胞和生殖细胞。随着花粉小孢子进一步发育,虽然营养细胞内的保留了完整的线粒体,但其DNA却发生了降解,而生殖细胞内的线粒体DNA却得到了保留,为线粒体父系遗传提供了可能,是黄瓜线粒体父系遗传直接的细胞学证据。2.黄瓜CsDPD1基因的克隆及功能验证基于同源性分析,发现黄瓜基因组中存在与拟南芥调控花粉细胞器DNA降解核酸外切酶基因AtDPD1同源的CsDPD1基因。转基因实验表明,CsDPD1基因能够恢复拟南芥Atdpd1突变体的表型,证明CsDPD1基因具有拟南芥AtDPD1基因类似的功能,参与了花粉中细胞器DNA的降解。因此推测黄瓜花粉营养细胞内线粒体DNA降解可能是由CsDPD1基因编码的核酸外切酶引起的,而生殖细胞内线粒体DNA的保留是该基因的表达受到了抑制或者干扰导致。3.黄瓜CsDPD1基因对花粉线粒体DNA数量的调控利用qPCR技术对黄瓜花粉发育过程中花粉所携带的线粒体DNA数量进行检测,并对CsDPD1基因的表达进行定量分析。结果表明,花粉内CsDPD1基因的表达与线粒体DNA的降解正相关,进一步证实了CsDPD1基因直接参与线粒体DNA的降解。利用单独分离的花粉生殖细胞的分析表明,虽然CsDPD1基因的表达量是其在幼嫩叶片中表达量的21倍,却依然含有大量的线粒体DNA;进一步通过分离黄瓜早期的胚胎,在授粉6天后,仅能检测到父系来源的线粒体DNA,并不能检测到母系来源的线粒体DNA残留,说明黄瓜父系来源线粒体DNA可能存在的保护机制,阻碍了CsDPD1对其降解。4.黄瓜CsDPD1核酸酶降解花粉营养细胞线粒体DNA的生物学功能分析利用qRT-PCR方法对CsDPD1基因在不同组织的表达水平进行了检测,并通过分离纯化线粒体,分析成熟叶片中线粒体DNA含量。结果显示,CsDPD1基因在同为营养物质匮乏的生殖器官、根以及衰老的叶片表达量较高,这些部位是已知的营养物质回收活动非常活跃的器官,包括DNA回收利用。并且3.3%的成熟叶线粒体不含DNA,也印证了线粒体DNA降解与CsDPD1基因在成熟叶中的表达量的关系。因此,综合花粉营养细胞本身的功能推断,CsDPD1基因参与花粉营养细胞内线粒体DNA的降解,主要的生物学功能可能是对营养物质的回收利用,供给花粉管的伸长以及双受精过程。


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