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上海地区规模化猪场蚊媒及其携带病毒的调查

吴亚玲  
【摘要】:蚊媒属于节肢动物门、昆虫纲、双翅目、长角亚目。蚊科分为3个亚科,即巨蚊亚科(Toxorhynchitinae)、按蚊亚科(Anophelinae)和库蚊亚科(Culicinae),其种类繁多,迄今全世界已知种类达40个属,200多种。蚊媒病毒是由吸血蚊媒作为媒介进行传播的,主要是通过蚊媒叮咬敏感的脊椎动物。病毒首先在蚊媒的体内利用蚊媒自身的成分不断繁殖,然后蚊媒病毒再被蚊媒传给脊椎动物,最终引起人畜共患病,引起了很严重的公共卫生健康问题。蚊媒病毒病大多属于自然疫源性疾病,在流行季节从自然界捕获的媒介蚊媒分离蚊媒病毒,是了解当地蚊媒病毒流行的重要手段之一。上海市是全球最大的港口之一,人口密度大,流动性强,来自世界各地的大量人群和物资可携带各种蚊媒及其病原至上海市。尽管每年只有少量输入性蚊媒病病例报告,但在当前的环境下仍有可能形成蚊媒传染病发生的潜在风险。为有效预防控制蚊媒病的传播和流行,帮助疾病控制部门开展公共卫生安全保障工作,本研究于2014年对上海地区大型规模化猪场进行蚊媒与蚊媒病毒调查,分析了上海地区蚊种构成、分布及蚊媒病毒的携带情况,为上海当地的蚊媒及蚊媒病毒的预防控制提供依据。具体研究内容如下:试验一.上海地区蚊媒调查2014年6月、7月、8月集中在上海市闵行区,奉贤区,浦东区,嘉定区共11家大型规模化养猪场,采用紫外捕蚊灯进行捕获,前一晚的六点在猪场3 m高处悬挂捕蚊灯并打开开关至第二天的早晨六点收集样本。将蚊媒样本存放入随身携带的小冰箱内,立即送回实验室。送回实验室后根据实验需要可以先拿出一部分进行品种分选,后续实验用的先保存于实验室的液氮罐中。结果:此次试验共采集到3属7种30 396只蚊媒标本,其中三代喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)共采集了 28 856只,占捕获总数的95%;二代喙库蚊(Culex bitaeniohynchus)采集了 688只,占捕获总数的2.26%,中华按蚊(Anopheles sinensii)捕获的数量是789只,占总数的2.6%;其它4种不常见蚊媒(骚扰阿蚊、微小按蚊、致倦库蚊、淡色库蚊)共63只,占捕获总数的0.18%。试验二.上海地区蚊媒携带病毒的分离与鉴定将已经按照蚊媒品种分类的蚊媒样本进行充分的研磨,后经3日龄小鼠脑内扩增和细胞上(BHK-21和C6/36)增值。参考Genbank中常见的蚊媒病毒如乙型脑炎病毒、甲病毒、黄病毒、辛德毕斯病毒、版纳病毒的基因序列,应用primer5.0软件设计了特异性的引物,并通过RT-PCR扩增条带,回收产物,连接载体后送测序;同时使用间接免疫荧光法(IFA)进一步进行鉴定。结果:本次试验共分离到16株蚊媒病毒,其中8株是乙型脑炎病毒(2株来自猪源,其余6只来自蚊源),8株版纳病毒(均来自蚊源)。试验三.上海地区蚊媒携带的乙型脑炎病毒的分子特征分析参考GenBank中已发表的JEV核苷酸序列,采用Primer 5.0软件设计了两对JEV特异性引物,使用QIAamp Virus RNA Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取病毒RNA,对提取的RNA样品进行反转录以获得cDNA链,对反转录获得的cDNA样品进行扩增。测序结果经BLAST后,再利用DNAStar软件包及MEGA 4.0等软件进行序列分析、JEV进化树的构建,核苷酸序列和氨基酸序列比较及分析。用JEV分离株脑内接种3日龄小鼠,梯度稀释病毒后,依次加入培养有BHK-21细胞单层的96孔板,设置阴性对照孔,逐日记录病变孔数,通过Reed-Muench两氏法计算TCID50。结果表明:分离的8株JEV病毒都有较强的致病性,选用Chen等建立的JEV基因分型方法进行进化树构建分析,结果显示:此次分离到的8株JEV毒株,其中有4株为GⅠ(蚊源的有3株,猪源的1株),有4株为GⅢ(蚊源的3株,猪源的1株)。8株分离株与经典毒株SA14-14-2的E基因核苷酸差异性为88%-98.2%,氨基酸差异性是86.5%-97.9%。JEV分离株之间的核苷酸差异是88.0%-100%,氨基酸差异是86.3%-100%。试验四.上海地区蚊媒携带的版纳病毒的分子特征分析在Genbank上下载版纳病毒序列,采用Primer 5.0软件设计了针对BAV第12片段的特异性引物,进行扩增回收,并连接T载体后送测序。测序结果经BLAST后,再利用DNAStar软件包及MEGA4.0等软件进行序列分析、BAV进化树的构建,核苷酸序列和氨基酸序列比较及分析。结果显示:上海首次分离到版纳病毒,版纳病毒的8个分离株之间的核苷酸序列比较,同源性都很高,可达99.5%~100%。与云南版纳株和北京版纳分离株的同源性分别为94.2-98.7%和98.3%-98.5%;与内蒙和印度尼西亚地区分离株的同源性分别为98.5%-98.8%和89.7%-90.7%;与匈牙利的版纳分离毒株亲缘性最远是44.5%-44.6%之间。此次分离的版纳病毒处于A2 一个较为独立的分支上,与北京和云南及内蒙分离株关系较近,即与A2亚型关系较近,与中国其它地区的分离株具有明显的差异性。


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