三叶青种质鉴别、悬浮培养及其活性组份诱导人肝癌HepG_2细胞凋亡机制研究

【摘要】：三叶青(TetrastigmahemsleyanumDiels etGilg)为葡萄科崖爬藤属多年生草质藤本植物。可用于治疗高热、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病,也是抗肿瘤常用药物。其野生资源濒临灭绝,且人工栽培难度大,药用部位地下块根生长周期长,药材市场上伪混品众多,缺乏快速有效的鉴别方法。药理研究表明三叶青对多种肿瘤细胞均有较强抑制作用,抗肿瘤实验研究中多采用其细胞毒活性较强部位—乙酸乙酯或氯仿部位的粗提物,但其抗肿瘤的分子机制及信号通路尚未明确。本研究探索了 ISSR、CAPS分子标记技术以及ITS2条形码在三叶青与其常见伪品以及近缘植物种质鉴别中的应用,探讨了钙信号在金属离子诱导三叶青悬浮细胞生长及其次级代谢产物合成过程中的作用,研究了三叶青提取物诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制,为三叶青种质鉴别、次级代谢调控、临床药效开发与评价提供了理论及实验依据。具体研究内容及结果如下:(1)优化了 ISSR-PCR反应体系,筛选出11条可用于三叶青遗传多样性评价的ISSR标记引物,建立了基于ISSR-PCR指纹图谱的三叶青及其伪品的UPGMA聚类图,结果显示:ISSR图谱产生的条带模式能够将三叶青与其不同属的伪品在DNA水平区分鉴别,却不能有效鉴别2种与其亲缘关系较近的同属伪品。(2)测定了三叶青及其伪品nrDNAITS2区序列,建立了基于nrDNAITS2区序列的三叶青及其伪品的NJ聚类图,结果显示:ITS2条形码遗传信息丰富,对三叶青种内或种间均有较好的鉴别效果,且浙江产区的三叶青表现出单系性,而其它产区三叶青样品没有明显表现出遗传分化与地理距离的相关性。(3)通过对三叶青与其近缘物种及其多种伪混品ITS2区序列分析得出的SNP位点,建立了一种快速、便捷、可靠的鉴别三叶青的CAPS方法,三叶青样品ITS2区PCR产物经NCO I酶切后产生约为300bp和200bp片段,而伪品PCR产物为500bp左右大小的单一条带,本方法无需测序、简单准确,且由于扩增目的片段短,受模板质量及PCR扩增条件的影响较小,不易出现假阴性的结果,具有重要的实用意义和较大的推广价值。(4)研究了三叶青提取物对人肝癌HepG2细胞周期阻滞和凋亡诱导作用,结果表明:处理组HepG2细胞出现细胞核碎片、染色质凝聚、凋亡小体、DNA Ladder等典型细胞凋亡特征,并呈剂量依赖性地下调了细胞周期调控蛋白CDK2的表达水平,从而导致了明显的S期细胞周期阻滞,因此,三叶青提取物抑制体外肝癌HepG2细胞增殖的作用与其诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用有关。(5)通过测定线粒体膜电位、Caspase酶活力、胞内游离Ca2+、凋亡相关蛋白表达水平的变化,并使用特异的启动性Caspase抑制剂分别阻断内源性和外源性通路的上游,比较细胞凋亡率变化,证实三叶青提取物经由依赖线粒体/细胞色素C的Caspase途径,通过调控凋亡相关基因Bc12、Bax、P53的表达,降低线粒体跨膜电位,基质Ca2+外流,Cytochrome c释放到胞浆,Caspase-9和PARP被剪切活化,从而激活其下游的Pro-Caspase-3,最终导致细胞调亡。(6)研究了 4种金属离子对三叶青悬浮细胞生长及其黄酮积累的影响,考察了外源Ca2+浓度以及Ca2+通道抑制剂/胞内钙调素拮抗剂对金属诱导子促进细胞生长、诱导黄酮生产效果及活性氧代谢的影响,结果表明一定浓度的Cu2+和Ce3+对细胞生长及黄酮的积累均有明显的促进作用。外源Ca2+浓度降低可以促进H2O2迸发和POD活性提高,激发防卫反应,从而增强其诱导效果。在三叶青悬浮细胞生产黄酮的过程中,可以通过适当降低培养基中钙离子浓度或加入钙离子的拮抗剂来促进金属诱导子的诱导效果,提高黄酮产量。