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解淀粉芽孢杆菌FZB42生防功能及环二肽激发子功能研究

吴黎明  
【摘要】:解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens FZB42具有出色的促进植物生长和拮抗植物病原微生物的能力。基因组测序结果分析表明它可以通过非核糖体途径和核糖体途径的基因簇合成大量的次级代谢产物,其中脂肽类化合物和聚酮类化合物具有重要的生防功能。已有文献报道芽孢杆菌可以抑制有害藻类的生长和繁殖,实验室前期研究发现FZB42能够显著地提高对于水稻白叶枯病菌的抗性,但具体的活性物质成分都尚未得到鉴定。环二肽是由两个氨基酸通过肽键环合形成,自然界中最小的、结构最简单的环肽化合物。环二肽被报道具有多种生物学功能,如群集信号分子功能、抗细菌、真菌活性及促生功能等。本研究对环二肽在烟草植株上的激发子活性进行了评估。主要研究结果如下:1.从实验室24株生防芽孢杆菌中筛选发现解淀粉芽孢杆菌FZB42对铜绿微囊藻的抑藻效果最好,抑藻率达到98.78%。FZB42主要是通过分泌胞外物质的间接方式起到抑藻作用。对抑藻活性物质的基本理化性质分析得知其具有一定的热稳定性和pH稳定性,可溶解在乙醇中且具有较好的亲水性,分子量在3kD以下。。通过筛选FZB42的随机突变体文库发现M436和M1 125抑藻能力缺陷。它们转座子插入位点分别为aro基因簇基因aroA和aroE。aro基因簇负责莽草酸途径,中间产物预苯酸为解淀粉芽孢杆菌FZB42通过非核糖体途径合成的bacilysin的初级合成前体。因此,我们推测解淀粉芽孢杆菌FZB42对铜绿微囊藻的抑藻活性与bacilysin有关。为了证实这一猜测,我们定点突变了负责bacilysin合成的bac基因簇中的bacB基因,发现FZB42△bacB丧失了抑藻活性。将其进行功能回复,同时从FZB42发酵液中分离纯化bacilysin和添加专属拮抗剂N-acetylglucosamine ,进一步证实抑藻活性物质为bacilysin。扫描电镜和透视电镜观察表明其可以破坏藻细胞细胞器膜系统和细胞壁,Quantitative real time-PCR检测发现处理后肽聚糖合成相关基因glmS、参与光合作用的基因psbA1、参与微囊藻毒素的合成基因mcyB和参与细胞分裂的基因ftsZ均发生下调表达;以上结果说明解淀粉芽孢杆菌FZB42分泌的抑藻活性物质bacilysin具有被开发成生防制剂治理有害藻类的巨大潜力。2.本研究通过比较平板拮抗实验FZB42各突变体抑菌圈的大小明确了 FZB42对水稻黄单胞菌Xanthomona spp.具有显著的抑菌作用的活性物质为bacilysin和difficidin。荧光显微镜、扫描电镜和透视电镜观察显示处理后会引起Xanthomonas细胞壁和结构的变化。温室实验表明bacilysin和difficidin处理后可以减轻水稻白叶枯病和细菌性条斑病的发病情况。同时,Quantitative real time-PCR检测Xanthomonas的毒性、生长、蛋白质合成和细胞壁合成相关基因均发生下调表达。3.我们为了提高FZB42中bacilysin的产量,将其bac基因簇的原始启动子替换成从质粒pMK3和pLOSS上克隆的强启动子PrepB和Pspac;为了去除筛选时的氯霉素抗性片段,设计引物时在启动子两端加上了 lox(lox71和lox66)位点,在温敏质粒pLOSS-cre上Cre重组酶的作用下,对lox位点之间的序列进行剔除和重新连接;接着50℃培养去除质粒pLOSS-cre从而获得无抗生素标记FZBREP和FZBSPA菌株。RT-PCR和qRT-PCR在转录水平上检测bac基因簇的表达量表明原始启动子被PrepB和Pspac取代后明显强于野生型。通过HPLC分析发现菌株FZBREP和FZBSPA的bacilysin产量比野生型分别高170.4%和315.6%。平板拮抗bacilysin指示菌株金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 和 生物防治马铃薯环腐病原菌 Clavibacter michiganense subsp.sepedonicum的结果也验证了这一结论。4.本研究将合成的8种环二肽处理烟草后评价其对烟草疫霉和TMV抗性发现只有cyclo(L-Pro-L-Pro)和cyclo(D-Pro-D-Pro)处理后能够引起烟草的系统抗性,疫霉和TMV的发病情况显著地减轻;进一步研究发现cyclo(L-Pro-L-Pro)和cyclo(D-Pro-D-Pro)处理后可以诱导烟草叶片气孔关闭;过氧化氢H2O2的累积;保卫细胞中Ca2+、NO和AOS含量增加。通过检测信号通路发现这两种环二肽能够引起PR-1a基因上调表达,PR-1a 蛋白的积累,SA 含量的增加,表明 cyclo(L-Pro-L-Pro)和 cyclo(D-Pro-D-Pro)是通过介导SA信号通路来引起防卫相关基因上调表达,最终赋予植物抗性。该研究说明环二肽具有成为诱导植物产生抗性的激发子的潜力,为其在生物防治植物病害方面提供了理论依据。


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