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解淀粉芽孢杆菌SQR9增强植物耐盐能力的机制研究

陈淋  
【摘要】:目前,世界上有20%的耕地受到盐害的影响,过量的盐分会影响作物生长,导致产量降低,严重限制农作物的产出。盐害除了会导致植物离子毒害和渗透胁迫,还会引起氧化伤害,因此有必要采取一些有效措施来增强植物的耐盐能力,其中根际促生菌(PGPR)被认为可以有效增强植物耐盐胁迫能力。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) SQR9是本实验室在健康黄瓜根际筛选到的一株根际促生菌,可以显著地促进黄瓜植物的生长。以SQR9为添加菌剂的生物有机肥可以有效地促进植物生长,抑制土传病害的发生。本文发现解淀粉芽孢杆菌SQR9不仅对植物有促生作用,还可以显著的增强植物对盐胁迫的耐受能力。通过研究接种SQR9对盐胁迫下植物耐盐相关生理指标和基因转录的影响,初步确定SQR9诱导植物耐盐胁迫的途径。通过对SQR9诱导植物耐盐胁迫的信号物质的研究及拟南芥突变体验证,确定了 SQR9诱导植物耐盐胁迫的主要途径,并发现亚精胺为SQR9产生的诱导植物耐盐的重要信号物质。获得如下主要结果:在水培和琼脂培养条件下,解淀粉芽孢杆菌SQR9可以增强玉米、水稻和拟南芥三种作物在不同盐浓度下的耐盐能力。在100 mMNaCl下,接种SQR9的玉米的茎叶和根部鲜重分别是对照组玉米的2.69倍和1.78倍,接种SQR9的拟南芥的茎叶和根部鲜重分别是对照组的2.85倍和1.9倍,且接种SQR9导致植物根部侧根的数量显著增加。在盐胁迫下,SQR9可以通过调控多个基因的表达来影响植物相关生理指标,如叶绿素、光合速率、脱落酸(ABA)、渗透调节物可溶性总糖(TSS)、抗氧化物酶、还原型谷胱甘肽(GSH)和Na+含量。RBCS和RBCL是植物光合作用关键基因,SQR9可以通过提高玉米内的ZmRBCS、ZmRBCL基因和拟南芥内AtRBCS、AtRBCL基因的转录水平来增强植物光合作用。同时在盐胁迫下,SQR9接种的玉米叶绿素和类胡萝卜素含量分别是未接种对照的1.84和1.44倍,而接种SQR9的拟南芥叶绿素和类胡萝卜素分别是对照组的3.39倍和3.35倍,同时在盐胁迫下SQR9的接种显著增强了玉米和拟南芥的光合速率。在盐害下,植物会通过提高ABA含量来调控气孔减少水分的丧失,而在盐胁迫下,接种SQR9分别降低了玉米和拟南芥内ZmNCED和AtNCED3基因(ABA合成的关键基因)的转录水平,抑制了玉米和拟南芥中ABA含量的升高。接种SQR9将玉米和拟南芥TSS含量增加为对照的2.29倍和1.47倍。接种SQR9虽然显著提高了玉米的过氧化物酶(POD)活性,但对拟南芥POD活性并没有显著的影响。接种SQR9的玉米的过氧化氩酶(CAT)活性是对照(添加等量失活SQR9菌液处理组)的1.75倍,接种SQR9的拟南芥的CAT活性增加到对照的2.19倍。接种SQR9的玉米内GSH含量是对照组的2.43倍,接种SQR9的拟南芥内GSH含量提高到对照组的2.49倍。在盐胁迫下,接种SQR9的植物内过氧化氢的含量显著低于未接种SQR9的植物。通过分根实验发现,在盐胁迫下接种SQR9导致根系环境中Na+含量显著高于未接种对照,说明SQR9能够协助植物排除Na+或者减少Na+的摄入。同时接种SQR9分别增加了玉米和拟南芥中Na+转运相关基因的转录水平,如SQR9增加了玉米中ZmNHX1,ZmNH2,ZmNHX3和ZmNH+-PPase基因的转录水平和拟南芥中AtNHX1和AtNHX7基因的转录水平,从而减少Na+对植物造成的伤害。通过透析袋截留不同分子量的SQR9分泌物,发现诱导植物耐盐的SQR9信号物质的大小在100 Da到500 Da之间。通过进一步检测该范围内的分泌物所影响的植物耐盐途径,发现100~500 Da的SQR9分泌物主要通过提高玉米的GSH含量并减少Na+含量来促进植物的盐胁迫耐受性。而在拟南芥中,100~500 Da的SQR9信号物质能够增强CAT的活性、提高GSH含量并减少植物体内Na+含量。并且,利用相关的拟南芥突变体进行验证,发现GSH合成相关基因(GS和GR)的敲除导致接种SQR9不能增强植物耐盐能力,以及盐过敏反应(SOS)途径关键基因(SOS1,SOS2,SOS3和NHX1)的敲除也会导致接种SQR9不能增强植物耐盐能力,该结果进一步证明了GSH含量的增加以及对SOS途径的调控是SQR9 100~500Da的信号物质协助植物耐受盐胁迫的主要途径。在对SQR9分泌的诱导植物耐受盐胁迫的信号物质的进一步研究中,我们发现SQR9产生的挥发性物质(VOCs)不能显著增强盐胁迫下拟南芥的生物量,说明VOCs并非是SQR9诱导植物耐盐胁迫的信号物质。△ysnE是SQR9的突变体,突变菌株的吲哚乙酸(IAA)产量显著降低了 86%,通过用△ysnE接种盐胁迫下的拟南芥,其相对应的拟南芥鲜重和侧根数目与接种野生型SQR9的拟南芥相比有所下降,但是与对照相比仍可以显著增强盐害下拟南芥的生物量,结果表明IAA并非是SQR9诱导植物耐盐胁迫的主要信号物质。通过用乙酸乙酯、乙醚、正戊烷、氯仿和水相萃取100~500 Da的SQR9发酵液,发现在盐胁迫下,拟南芥茎叶的生物量在添加未经过萃取的SQR9发酵液、水相SQR9发酵液、乙醚萃取的SQR9发酵液和氯仿萃取的SQR9发酵液的处理中相对于对照组分别提高了 75.75%、34.68%、53.21%和95.43%。而只有未经过萃取的SQR9发酵液、乙醚萃取的SQR9发酵液和氯仿萃取的SQR9发酵液导致拟南芥根鲜重的显著增加,增加幅度分别为35.75%、20.75%和70.9%,乙酸乙酯和正戊烷萃取的SQR9发酵液并没有显著增加拟南芥生物量。其中氯仿萃取的SQR9发酵液诱导植物耐盐胁迫效果最佳,因此推测SQR9信号物质应极易被氯仿萃取。据报道,100~500Da之间的潜在的促进植物耐受盐胁迫的物质主要包括赤霉素、玉米素、海藻糖和多胺类,通过液相色谱(HPLC)检测SQR9发酵液,发现SQR9不能产生精胺,只能产生亚精胺。此外通过检测100~500 Da的潜在信号物质在上述溶剂中的溶解度,发现只有亚精胺在氯仿中的溶解度较高,该结果显示,SQR9所分泌的能够诱导植物耐受盐胁迫的信号物质可能是亚精胺。实验发现,外源亚精胺增强植物耐盐的有效浓度范围是1~10μM,但是当浓度大于500 μM时对植物生长有抑制甚至致死作用。我们在SQR9找到了完整的亚精胺合成途径,并通过同源重组双交换,敲除SQR9内亚精胺合成关键基因speB,得到突变子△speBB,并构建了相应的互补菌株c-△speB。通过HPLC对野生型SQR9、△speB、c-△speB菌株的亚精胺的产量进行了分析,野生型3QR9和c-△speB胞外亚精胺的产量分别是26.40μM和22.20μM(OD600=1.0),胞内亚精胺的产量是29.93和26.59μM (OD600=1.0),而突变子几乎不产亚精胺,突变子和互补菌株的生长曲线与野生型无显著差异,说明speB基因的敲除和互补载体的融入并没有影响到细菌的生长。接种突变子△speB不能增强植物的耐盐能力,互补菌株c-△speBB仍可以显著增强植物耐盐能力,说明亚精胺是SQR9诱导植物耐·盐胁迫的重要信号物质。进一步研究发现,亚精胺能够促进植物GSH合成相关基因GS和GR的表达,并提高植物GSH含量,从而缓解植物受到的氧化伤害;还能够调控液泡上Ca2+通道蛋白基因TPC1的表达来改变细胞质内Ca2+含量,从而激活SOS途径,并提高液泡膜和细胞膜上的Na+通道蛋白基因NHX1和NHX7的表达来调节Na+的区域化,从而减少了植物细胞质内的Na+含量。综上所述,SQR9能够通过影响植物多条途径促进植物对盐胁迫的耐受能力,主要通过合成亚精胺来促进植物GSH的合成,从而缓解植物受到的氧化伤害;通过调控细胞质内Ca2+含量来激活SOS途径;以及调控Na+的区域化来减少植物细胞中的Na+,从而达到协助植物耐受盐胁迫的效果。


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