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离心去脂对猪孤雌激活胚胎的影响及机制研究

牛英杰  
【摘要】:脂滴一方面作为卵母细胞和早期胚胎发育过程中重要的能源物质,对卵母细胞成熟和胚胎的发育至关重要;另一方面,由于猪卵母细胞和早期胚胎中脂滴含量非常丰富,对冷冻敏感性极高,因此,猪的卵母细胞和胚胎的冷冻效率一直非常低。研究表明通过机械的离心去脂虽然可以显著提高猪卵母细胞和胚胎的冷冻效率,但是,部分研究表明去脂会影响胚胎发育的效率及胚胎的质量。不同的研究结果也表明离心去脂对猪胚胎的发育没有影响。关于这方面的研究多是通过简单的观察统计进行的,而且数量很少。因此本研究通过对离心去脂胚胎发育过程中脂滴、线粒体和内质网等细胞器进行观察分析,结合细胞内能量代谢水平,来系统的揭示离心去脂对猪孤雌激活胚胎发育的影响及机制。选择MⅡ期卵母细胞先部分消化透明带,然后再进行高速离心,之后彻底去除透明带,孤雌激活后在WOWs培养系统中培养到第6天。1、离心去脂显著降低猪孤雌激活胚胎发育潜能在胚胎体外培养的24h、36h和144小时,分别统计去脂组和对照组2-细胞、4-细胞和囊胚的发育效率,通过Hoechst 33342染色检测第6天的囊胚细胞数。结果发现去脂组和对照组的2-细胞率和4-细胞率都没有差异(95.83±2.25%vs.97.44±0.67%;79.17±4.47%vs.84.62±1.19%)。去脂组囊胚率显著低于对照组(21.67±3.78%vs.49.36±1.77%),两组细胞数没有显著差异(37.92 vs.41.88)。2、离心去脂对猪孤雌激活胚胎发育过程中脂滴的影响收集对照组和去脂组MⅡ期卵母细胞和孤雌激活后12h、24h、36h和144h的1-细胞、2-细胞、4-细胞和囊胚,PFA固定后用油红O染色。结果发现去脂组的MⅡⅡ期卵母细胞中,脂滴数量很少,剩余的大多为小脂滴,且都被极化到了卵母细胞的一边。在去脂组早期胚胎中(1-到4-细胞),部分脂滴形成了一个环状的结果围绕细胞核分布,其余分布在细胞外周。当胚胎发育到囊胚期时,无论对照组还是去脂组,脂滴都均匀分布在内细胞团和滋养层细胞。去脂组中的脂滴含量从MⅡ卵母细胞到囊胚阶段保持不变,但是脂滴的体积在逐渐减小。3、离心去脂对猪孤雌激活胚胎发育过程中线粒体的影响收集对照组和去脂组MⅡ期卵母细胞和孤雌激活后的1-细胞、2-细胞、4-细胞和囊胚,用MitoTracker Red CMXRos(MTR)染色后PFA固定观察。结果发现离心过程中少量线粒体会随脂滴被离出细胞外,剩余线粒体被极化到卵母细胞的一边。去脂胚胎发育过程中线粒体的分布会发生变化且与对照组分布相同。在1-到4-细胞期间,线粒体主要分布在各卵裂球的外周。但是到囊胚时期时,线粒体均匀的分布在内细胞团和滋养层细胞。利用荧光定量PCR检测mtDNA拷贝数发现,从MⅡ卵母细胞到囊胚期的无论哪个时期,对照组和去脂组胚胎的mtDNA拷贝数都没有显著差异。而且在对照组和去脂组中mtDNA拷贝数都是从MⅡ卵母细胞到4-细胞逐渐降低,随后与囊胚期保持一致。4、离心去脂对猪孤雌激活胚胎发育过程中内质网的影响收集对照组和去脂组MⅡ期卵母细胞和孤雌激活后1-细胞、2-细胞、4-细胞和囊胚,用ER-TrackerTMGreen染色后观察。结果发现离心去脂主要影响内质网在MⅡ期卵母细胞中的分布形式。在对照组MⅡ卵母细胞中,内质网簇被分散分布在整个胞质中,离心后被极化到细胞的一边。在胚胎发育过程中对照组和去脂组内质网分布相似。1-到4-细胞中,内质网簇部分分布在卵裂球的皮质层,其余的主要分布在细胞核的周围,形成一个明显的内质网荧光密度环。在对照组和去脂组的囊胚中,内质网簇被均匀分布在内细胞团和滋养层细胞,而且,可以清楚的看到在内细胞团和滋养层细胞中,都会形成明显的围核荧光密度环。通过细胞骨架抑制剂的添加实验表明,内质网在去脂MⅡ卵母细胞到1-细胞期间的恢复主要是微丝介导的。5、离心去脂对猪孤雌激活胚胎发育过程中ATP的影响收集孤雌激活后的1-细胞、4-细胞和囊胚,利用荧光素酶ATP检测系统检测胚胎内ATP的含量。结果发现只有在1-细胞时期,去脂组的ATP含量显著低于对照组(p0.05),而在其他时期(4-细胞和囊胚时期),去脂组和对照组胚胎内ATP含量没有显著差异(p0.05)。但是,在去脂组和对照组中,随着胚胎从1-细胞到囊胚的发育,ATP的含量都是逐渐降低的。


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