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硫磺菌凝集素的分离纯化、结构解析及理化性质研究

武奔月  
【摘要】:硫磺菌(Laetiporus sulphureus(Fr.)Murrill),是一种食药兼用的大型真菌。幼嫩的硫磺菌子实体,可食用且味道鲜美。老熟后不宜食用,如干酪状,但可用作药物。真菌凝集素在防御、抗肿瘤、促有丝分裂以及调节细胞-细胞与基质间的反应等方面发挥着生物学功效。目前国内外对硫磺菌凝集素的研究较少,对其分离纯化及结构方面的研究更是不够全面。本文研究的主要内容是硫磺菌凝集素的提取工艺、分离纯化方法,并对其结构进行解析和理化性质进行初探。首先对硫磺菌凝集素的提取工艺进行研究。选择氯化钠浓度、液料比、提取温度、提取时间和浸提pH值分别进行单因素实验,最后选择氯化钠浓度、液料比、提取温度和提取时间进行四因素三水平的正交实验设计,得到硫磺菌凝集素的最佳提取工艺为:氯化钠浓度0 mol/L,液料比30:1(mL/g),提取温度15℃,提取时间10 h,浸提pH值7.5。在此条件下,其凝集活性为0.5870 UH/mL,蛋白得率达到0.576%。将提取出的硫磺菌凝集素进行分离纯化。利用硫酸铵分级沉淀对目的蛋白进行沉淀,得到最佳硫酸铵饱和度分级范围为20%~70%。而后利用DEAE-cellulose-52初步分离经硫酸铵沉淀的样品,得到D1、D2、D3、D4和D5五个组分。其中组分D3凝血效价最大,达到28,得率为9.2%。最后利用Sephadex G-100层析柱将D3组分分离纯化,得到单一峰,记为D3S1,凝血效价为28,得率为20.3%。经苯酚-硫酸法测定,得D3S1样品的糖含量为4.81%,可知硫磺菌凝集素是一种糖蛋白。由SDS-PAGE电泳和Native-PAGE电泳结果可知,硫磺菌凝集素分子量为52.0 KDa,由分子量大小为35.1 KDa和23.7 KDa的两个亚基组成,且纯度达到电泳级别。采用溴化钾压片法对纯化的硫磺菌凝集素进行红外光谱扫描,结果表明,在4000 cm-1~400cm-1范围内呈现出典型的蛋白质吸收峰,进一步说明被检测样品为蛋白类物质。硫磺菌凝集素经氨基酸组成分析可知,含有17种氨基酸,氨基酸种类比较齐全。其中天冬氨酸、谷氛酸、亮氨酸和苏氨酸含量较高,分别为9.89%、9.41%、6.27%和6.04%;半胱氨酸和甲硫氨酸含量较低,分别为1.00%和1.33%。对硫磺菌凝集素进行圆二色光谱分析可知,α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲的含量分别是24.2%、33.8%、19.3%和34.3%。原子力显微镜观察硫磺菌凝集素的外观形貌。硫磺菌凝集素为椭球蛋白单体,蛋白直径为100~200 nm,高度为5~20 nm,未观察到糖链结构。对纯化后的硫磺菌凝集素进行理化性质的初步研究。乳糖对凝血效价有抑制作用,完全抑制其凝血效价的最小浓度为100mmol/L,而葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖等无抑制作用;硫磺菌凝集素在酸性环境中相对比较稳定,而在碱性环境中不稳定;当温度达到80℃以上,凝血效价为零,可知硫磺菌凝集素对热较不稳定;对硫磺菌凝集的凝血效价抑制最强的阳离子是Fe3+,其次是Al3+和Ca2+,而Mg2+、Znn2+和Mn2+三种阳离子对其凝血效价无影响。


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