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RP-Arg和NCG对妊娠期营养限饲湖羊胎儿和胎盘发育的影响

孙玲伟  
【摘要】:湖羊具有性成熟早、繁殖力强和肉质鲜嫩等特点,是我国宝贵的肉毛兼用型绵羊品种之一。目前,随着湖羊饲养规模的扩大和饲养方式的不断转变,多种饲养问题也陆续出现,且由于其多胎特性,易造成妊娠期湖羊营养元素的摄取不足,进而可能导致胎儿宫内生长受限(IUGR)。精氨酸(Arg)是机体内合成蛋白质、一氧化氮(NO)和多胺等多种物质的前体,能够调控胎盘的营养运输,参与组织中蛋白质合成等多种生理过程,对胎盘和胎儿的发育具有重要调节作用。由于Arg在瘤胃内易降解,且生产中饲喂瘤胃精氨酸(RP-Arg)价格相对较高,N-氨甲酰谷氨酸(NCG)可以增强内源性Arg的产生,且瘤胃降解率低,价格低于RP-Arg。目前,RP-Arg和NCG对缓解妊娠期湖羊营养不良造成的胎儿IUGR研究较少,对胎盘和胎儿发育的机理也未见深入研究。基于此,本论文主要研究湖羊妊娘期营养限饲条件下,母体日粮中添加RP-Arg 和 NCG 对胎儿和胎盘生长发育的影响。试验分为如下五部分:1.不同妊娘期湖羊血液代谢组变化规律的研究本试验以不同妊娘期健康湖羊为研究对象,利用代谢组学技术探究母羊生理状态下血液代谢组变化规律。本试验选取怀有双羔的妊娠母羊(n = 8),自妊娠50 d至110 d,每隔20d采集胎儿颈静脉血液并称重,记录体重,测定母羊采食量。试验期间母羊日粮按照NRC(妊娘期绵羊营养需要量)进行配制。对妊娘50 d、70 d、90 d和110 d四个时间点(分别为T1,T2,T3和T4)的母羊血液样品进行代谢组学的一维氢谱核磁共振技术(1H-NMR)检测,从而比较不同时间点之间妊娠期母体的代谢变化。随妊娠时间的延长,母羊的体重和采食量差异显著(P0.05),并随之增加。对代谢数据进行多元统计分析,主成分分析结果显示时间点T2和T3的代谢状态逐渐远离T1,且时间点T4与T1处的代谢状态相差最多。对1H-NMR谱图识别到的36种代谢物进行差异分析,共检测出13种差异代谢物(P0.05),这些代谢物主要与氨基酸代谢和脂类代谢相关。其中,母体血浆中首次检测到1-甲基组氨酸和丙二酸的变化。该结果表明代谢组学检测平台能够用于评估绵羊不同妊娠时间点的血液代谢状态。在湖羊妊娠期,体内氨基酸代谢和脂类代谢对满足其营养需求尤为重要。2.RP-Arg和NCG对营养限饲湖羊胎儿脐静脉血的代谢组学研究IUGR是动物妊娠期主要的并发症,易造成胎儿的高死亡率,且影响胎儿出生后的生长发育。Arg作为一种重要的必需氨基酸,能够促进动物生长和繁殖的重要作用。NCG是机体内合成Arg的关键酶,且在反刍动物瘤胃中降解率较低。本试验通过在营养限饲妊娠湖羊的日粮中添加过RP-Arg和NCG,利用代谢组学的1H-NMR检测胎儿脐静脉血浆样品,从而探讨母体营养对胎儿代谢的影响。本试验选怀有双羔的32只湖羊随机分为四组,每组8只,分别为:对照组(CG组;100%NRC);限饲组(RG组;50%NRC);处理组1(ARG组,50%NRC日粮基础上添加20 g/d的RP-Arg);处理组2(NCG组,50%NRC日粮基础上添加5 g/d的NCG),试验期为妊娠35 d至110 d。在妊娠110 d时屠宰,分别对母体和胎儿称重,并采集胎儿脐带静脉血样品。利用1H-NMR技术检测胎儿脐静脉血浆后,对数据进行多元统计及分析相关代谢物的代谢通路。四组血浆中共检测出36个代谢物,其中32个代谢物在四组间均差异显著(P0.05),且主要参与机体内氨基酸、碳水化合物、脂类、能量以及氧化应激等代谢通路的调控。研究结果表明,通过对妊娠期营养限饲湖羊日粮中补充RP-Arg和NCG,可调节胎儿体内的多种代i谢通路,进而提高胎儿的生长发育。3.RP-Arg和NCG对营养限饲湖羊胎盘发育的影响本试验通过对妊娠母羊进行营养限饲,并在母羊日粮中添加RP-Arg和NCG,探讨对肉阜和子叶发育的影响。在妊娘35 d,32只妊娠湖羊随机分为四组(CG、RG、ARG和NCG组)。在妊娠110 d时,对所有母羊进行屠宰和样品采集,并记录四组胎盘重量,分析测定胎儿脐静脉血液中代谢物浓度、胎盘中血管生长相关因子以及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路中关键因子的表达。结果显示,妊娠期母体营养限饲降低胎儿重/胎盘重比值(P0.05),但母体营养限饲、RP-Arg和NCG添加对胎盘重量无明显影响(P0.05)。四组间肉阜和子叶组织中血管内皮生长因子A(VEGF)、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1、胎盘生长因子-1(PLGF1)、血管生成素-1(Ang-1)和血管生成素-2 Ang-2)基因的mRNA表达量差异不显著(P0.05),但RG组肉阜和子叶中血管内皮生长因子受体-2(VEGFR 2)的mRNA表达量显著高于CG组(P0.05),而RG组酪氨酸激酶受体-2(Ti-)表达量显著降低(P0.05)。此外,母体营养水平也影响了肉阜和子叶组织中mTOR通路关键因子核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶(p70S6K)和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)蛋白及其磷酸化的表达水平。这些结果表明母体营养限饲会影响胎盘发育,而母羊日粮中补充RP-Arg和NCG能够通过调节子叶和肉阜中血管生长相关因子以及mTOR通路中关键因子的表达,促进胎盘的生长发育。4.RP-Arg和NCG对营养限饲湖羊胎儿氣基酸代谢和生长轴相关基因表达的影响本试验通过在妊娠期营养限饲母羊中添加RP-Arg和NCG,探讨其对胎儿发育的影响。本试验选取怀有双胎的母羊,在妊娠35 d随机分为四组(CG组、RG组、ARG组和NCG组)。妊娠110 d时,对所有母羊进行屠宰和样品采集,并记录分析胎儿各器官占胴体重,测定并分析胎儿血浆中代谢物和激素浓度、胎儿肝脏和背最长肌中氨基酸浓度,以及下丘脑-垂体-肝脏/肌肉中生长相关基因的mRNA表达量。结果显示,ARG组和NCG组中胎儿的多个器官比显著高于RG组(P0.05);RG组胎儿血浆中胰岛素(INS)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、总氨基酸(TAA)、乳酸(LD)、甲状腺素(T3)、甲状腺素/三碘甲状腺原氨酸(T4/T3)显著低于其他三组(P0.05),RG组中生长激素(GH)、游离脂肪酸(NEFA)和总胆固醇(TC)含量高于其他组(P0.05)。同时,限饲母体日粮中添加RP-Arg和NCG可以显著提高胎儿肝脏和肌肉中多种氨基酸的含量,并调控胎儿生长轴中相关生长基因的mRNA表达量。结果表明营养限饲条件下的母体通过在日粮中添加RP-Arg和NCG可以提高胎儿内分泌平衡、增加胎儿肝脏和肌肉中氨基酸的可用性,影响生长轴相关生长基因的表达水平。5.RP-Arg和NCG对营养限飼湖羊胎儿肝脏发育的影响本试验的目的是探讨在妊娠期营养限饲湖羊日粮中添加RP-Arg和NCG对胎儿肝脏的生长发育、组织结构、抗氧化和抗凋亡能力的影响。本试验选取怀有双胎的母羊,在妊娠35d至110d分为四组(CG组、RG组、ARG组和NCG组)。RG组胎儿肝脏中干物质、水、脂肪、蛋白质和灰分的含量显著低于CG组(P0.05),而NCG组肝脏中这些物质含量显著高于RG组(P0.05)。RG组胎儿肝脏中DNA、RNA和蛋白质的浓度、RNA和蛋白质含量,以及蛋白质、蛋白质/DNA的值显著低于CG组(P0.05),而NCG组DNA、RNA和蛋白质的浓度、蛋白质含量,以及蛋白质、蛋白质/DNA的值显著高于RG组(P0.05)。RG组中肝脏组织中胆碱酯酶(CHE)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,以及胎儿血液中谷丙转氨酶(ALT)和总蛋白(TP)含量显著低于CG组(P0.05),而谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和谷草转氨酶(AST)含量显著高于CG组(P0.05)。RG组胎儿肝脏的p53和Bax的mRNA表达量显著高于CG组,而FasL和Bcl-2的mRNA表达量、Bcl-2/Bax的值以及Bcl-2蛋白的表达量显著高于对照组Bcl-2。这些结果表明,母体的营养状态将改变胎儿肝脏的发育进程。母体日粮中添加RP-Arg和NCG可以改善胎儿肝脏的生长发育,并提高胎儿肝脏抗氧化和抗凋亡能力。


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