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大豆疫霉转录因子PsMAD1与效应子PsAvh238的功能分析

吴嘉维  
【摘要】:大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的大豆根腐病是大豆生产上的一种毁灭性病害。在形态学和生理学上,疫霉菌类似于高等丝状真菌,但在进化上归于包含硅藻属和褐藻属等藻类的茸鞭生物界,这种差别直接导致许多针对真菌的杀菌剂对疫霉病的防治没有效果。疫霉菌由于是二倍体且基因同源重组率极低,在过去相当长时间里,只能利用RNA干扰技术(基因沉默)研究基因的功能,由于沉默水平不可预测且往往不理想,筛选沉默转化子费时费力,效率很低。最近,Tyler等报道了CRISPR/Cas9系统在大豆疫霉基因组定点编辑中的成功应用,该系统只需合成一个sgRNA和Cas9就能实现对基因的特异性修饰,操作简单,显著提高了疫霉菌基因功能的研究效率。转录因子是基因表达调控网络中的关键因子,在病原菌致病等相关生物学过程中发挥着重要作用。实验室前期对一个MADS-box转录因子PsMAD1进行研究,发现沉默该基因影响大豆疫霉游动孢子产量、致病力和对各种外界胁迫的应答,为进一步验证该转录因子的生物学功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统对PsMAD1进行敲除,得到三个敲除突变体(T57、T69、T94)。对突变体进行表型分析,发现PsMAD1敲除突变体对菌丝的生长速率以及非生物胁迫的应答与野生型对照无差别;而在孢子囊的发育和割裂,游动孢子的形成和释放,侵染大豆等方面表现出显著的功能缺失。PsMAD1的缺失导致孢子囊不能释放游动孢子,转而直接萌发,菌丝接种大豆叶片和黄化苗下胚轴后致病力下降。探究孢子囊不割裂的原因,发现缺失PsMAD1的生物学功能导致孢子囊内原生质体不能正常割裂,细胞核排布异常。转录因子可以通过调控基因表达来传递信号,而许多效应子编码基因能够在侵染过程中上调,促进病原菌侵染。由于PsMAD1与大豆疫霉的致病性相关,推测一些效应子基因的转录可能受其调控。本研究比较了野生型大豆疫霉和PsMAD1敲除突变体在侵染大豆黄花苗的过程中18个RXLR效应子基因的转录水平,发现PsAvh238的表达量在PsMAD1敲除突变体侵染黄化苗时显著下调。前期研究中已发现沉默PsAvh238导致大豆疫霉的致病力显著下降,为进一步验证该基因的生物学功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统介导的Non-Homologous End Joining突变方法对PsAvh238的基因组序列进行编辑,通过引起插入或缺失破坏基因的开放阅读框(ORF),使得翻译提前终止而导致基因突变。对获得的三个突变体(T32、T41、T95)进行表型分析,发现PsAvh238敲除突变体的菌丝生长速率与野生型及对照菌株均无差别;而接种黄化苗下胚轴后致病力显著下降,证明了 PsAvh238是一个与致病性相关的效应子。关于MADS-box转录因子PsMAD1是否调控效应子PsAvh238的转录的问题,有待在后续的研究中进行分析。


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