沙雷氏菌FS14（Serratia marcescens FS14）中灵菌红素合成及调节相关蛋白的研究

【摘要】：灵菌红素(prodigiosins,PG)是一类具有三吡咯环结构的暗红色的脂溶性色素,是由放线菌、沙雷氏菌及一些其他细菌产生的次级代谢产物。灵菌红素的生物合成由MAP(2-methyl-3-n-amyl-pyrrole)和 MBC(4-methoxy-2,2'-bipyrrole-5-carbaldehyde)两条分支途径组成。PigG蛋白是一类酰基载体蛋白,参与MBC合成途径中的第一步,PigG的巯基与PigI活化后的L-Pro上的脯氨酰基基团连接形成中间产物L-prolyl-S-PigG,在PigA蛋白的作用下进行两步脱氩,形成灵菌红素三吡咯结构中的A环。为了明确PigG蛋白的催化机制,本研究以S.marcescens FS14的基因组为模板,克隆、表达并纯化得到PigG蛋白,用得到的高纯度且聚合状态单一的蛋白筛选结晶条件,优化蛋白晶体,最终通过X-射线衍射的方法收集到2.1A的衍射数据。通过数据处理,本研究用分子置换的方法解析了 PigG蛋白晶体的三维结构。PigG蛋白的二级结构由四个α-螺旋(α1-α4)组成,α1与α2螺旋几乎反向平行,较的α3与α1和α2垂直,α4与α2大约呈45°角,其中四个螺旋中最长的α2包含14个氨基酸。将PigG与其它结构相似的蛋白进行序列比对,发现位于α2顶端的第36位丝氨酸是一个保守的氨基酸。本研究还对PigG的功能以及PigG中保守的第36位的丝氨酸进行了研究,结果发现,pigG的缺失,或将36位丝氨酸突变为丙氨酸都会导致灵菌红素不再合成,因此,PigG对灵菌红素合成至关重要,Ser36可能是PigG的配体结合位点。CpxRA是一种重要的双组份系统(two component system,TCS),包括组氨酸蛋白激酶CpxA和反应调节蛋白CpxR。CpxA位于细菌细胞内膜上,主要参与感受细菌外包膜压力的变化,通过自身磷酸化使自身保守的组氨酸磷酸化,然后将磷酸基团转移至位于细胞质的反应调节蛋白CpxR的天冬氨酸残基上,磷酸化的CpxR作为转录调控因子结合到靶基因启动子区的特异序列,调节靶基因的转录,进而应对复杂的环境变化。本研究构建了沙雷氏菌Serratia marcescens FS14 cpxA基因的缺失突变株,发现突变株灵菌红素产量降低,而且cpxA基因的缺失突变对FS14菌株的运动性、抗药性以及50KD胞外蛋白酶的分泌均有影响。为了进一步研究CpxRA系统对灵菌红素合成的调控机制,本研究通过pigA-O基因簇启动子融合lacZ的方法对CpxRA系统调节灵菌红素合成的机制进行了研究,β-半乳糖苷酶活性测定的结果显示,FS14△CpxApigA-lacZ的β-半乳糖苷酶活性大幅下降,而FS14△CpxRpigA-lacZ和FS14△CpxR+ApigA-lacZ和野生型FS14pigA-lacZ相比没有显著变化,这说明CpxA参与灵菌红素合成的调节,它可能是通过调节灵菌红素合成相关基因簇pigA-O的转录来调节灵菌红素合成的。