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枯草芽孢杆菌作为细菌活载体递呈HA蛋白和PB1-F2蛋白及其免疫效果的研究

黄金凤  
【摘要】:近年来,禽流感的频繁的爆发不仅给我国养禽业造成重大经济损失,同时也对公共卫生安全形成巨大的威胁更为严重的是禽流感病毒不时跨种传播给人并引起死亡。因此引起了社会各界及科学家的广泛关注。当前,我国控制禽流感最广泛通用的方法是使用全病毒灭活疫苗。对动物来说,禽流感病毒主要通过呼吸道和胃肠道表面黏膜侵入机体,因此黏膜免疫的研究对禽流感病毒的防治是非常必要的。近年来新兴的黏膜免疫,具有简单、安全、方便等优点,受到越来越多的关注。对动物来说,黏膜是病原体的主要入口,口服疫苗在经机体口服进入肠胃道后,可以有效激发动物肠黏膜免疫。但是黏膜免疫也存在一些不足,如口服疫苗在经过肠胃时容易受到环境影响从而破坏口服疫苗的成分等,这在一定程度上影响了黏膜免疫疫苗的推广和使用。本研究中所选细菌活载体疫苗可以有效缓解口服黏膜免疫疫苗的不足之处。枯草芽孢杆菌作为抗原递呈载体具有突出优势。首先枯草芽孢杆菌具有成熟的遗传操作系统;其次能诱导肠道黏膜免疫反应;最后具有抗逆性强和生产方便等优势。因此,本研究构建了重组枯草芽孢杆菌来评价其对动物体的黏膜免疫效果。本研究首先克隆了 H5N1禽流感病毒的血凝素蛋白HA的基因序列和H9N2禽流感病毒的PB1-F2的基因序列以及绿色荧光蛋白GFP的基因,在此基础上将上述片段通过infusion融合的方式插入整合型载体pInAmyECotG中。构建的重组载体经双酶切及测序鉴定正确后,利用电击转化技术将其转入到枯草芽孢杆菌WB600基因组中,之后采用Western-Blot方法对该蛋白进行检测,结果显示本研究所活得的重组枯草芽孢杆菌可以成功表达HA和PB1-F2蛋白。为了研究本研究所获得的重组枯草芽孢杆菌pInCotGHP对动物的免疫效果。首先我们在体外细胞水平上应用重组枯草芽孢杆菌刺激分离培育的鸡骨髓源树突状细胞。流式细胞术检测结果表明重组枯草芽孢杆菌与野生型枯草芽孢杆菌对照组相比,能显著诱导树突状细胞的成熟。接着我们又将重组枯草芽孢杆菌以口服方式免疫小鼠和雏鸡。在小鼠的免疫实验中,我们总共免疫2次,买回之后第二周和第四周各免一次。利用流式细胞术检测小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结中T细胞的变化情况,以及利用血凝抑制试验检测小鼠血清中免疫抗体水平的变化。结果发现,口服该重组枯草芽孢杆菌与口服野生型枯草芽孢杆菌对照组相比,能诱导脾脏和肠系膜淋巴结CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的增殖,同时重组枯草芽孢杆菌在一定程度上刺激机体产生有效的禽流感特异性抗体。但是在鸡的免疫实验中,免疫次数和小鼠一样,我们研究了鸡的全身抗体免疫水平变化,同时与禽流感灭火疫苗的免疫效果进行了比较。结果显示,口服重组枯草芽孢杆菌组与皮下注射禽流感灭火疫苗组相比,鸡体产生的禽流感特异性抗体水平较低,并低于有效的血凝抑制效价临界值。口服重组枯草芽孢杆菌组相比于口服PBS组和野生型枯草芽孢杆菌组,鸡体能够产生禽流感特异性特异性抗体。上述研究结果表明,重组枯草芽孢杆菌pInCotGHP可以有效增强机体的黏膜免疫应答。同时也能刺激机体产生较低的禽流感特异性抗体水平。因此,口服重组枯草芽孢杆菌为家禽禽流感的预防免疫提供了一条新思路。


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