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大豆疫霉RXLR效应分子Avh238和Avh241的功能及作用机制研究

杨波  
【摘要】:大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一,每年在全球范围内造成了严重的经济损失。目前最有效的防治大豆疫霉的措施是使用抗病品种,然而,由于疫霉菌效应分子的快速变异,导致单一抗病品种很快会被疫霉菌克服,所以目前如何防治大豆疫霉引起的病害仍是大豆生产上的一大难题。对大豆疫霉致病机制的研究将有助于我们开发新的抗病技术,控制此病害的发生。本实验室前期工作通过生物信息学分析,发现大豆疫霉基因组中编码400多个RXLR类效应分子,研究表明RXLR效应分子可以通过精确转录调控和团队协作的方式抑制植物的免疫反应,但是这些效应分子干扰植物免疫的相关机制,目前仍知之甚少。本研究在实验室前期的研究基础上,针对大豆疫霉RXLR类效应分子Avh238和Avh241在疫霉菌与植物互作过程中可能发挥的功能进行了分析,并探索了这两个能够在多种植物上诱导细胞死亡的效应分子操控植物免疫的分子机制。主要研究结果如下:大豆疫霉效应分子Avh238的田间变异及其诱导植物细胞死亡的功能分析。分析发现Avh238P6497能够在包括烟草、番茄、马铃薯、茄子在内的多种植物上诱导细胞死亡,而Avh238P7076不能诱导植物细胞死亡。通过对全国范围内采集到的不同大豆疫霉菌株中Avh238序列变异的调查,发现其具有丰富的序列多态性,预示着它在进化过程中承受着强的选择压力。通过正向选择压力承受位点预测及大量点突变分析,发现Avh238第79位氨基酸为其诱导植物细胞死亡的关键位点。进一步对Avh238的亚细胞定位分析发现其在烟草细胞质和细胞核内均有定位,且其细胞核的定位决定了 Avh238具有诱导植物细胞死亡的能力。通过在烟草上沉默植物PTI及ETI通路关键基因,鉴定到烟草MEK2参与到Avh238诱导的植物细胞死亡途径。本研究结果发现Avh238能够通过单个核苷酸位点的变异,从而逃避植物的识别。Avh238的毒性功能分析。利用CRISPR/Cas9技术突变了大豆疫霉中的Avh238,发现大豆疫霉的致病性显著下降,表明Avh238是大豆疫霉毒性必需的效应分子。通过分析Avh238的定位与其抑制植物免疫的关系,发现Avh238的细胞质定位对于其抑制INF1诱导的细胞坏死是必需的。通过对Avh238删除突变体的功能进一步分析,发现保留Avh238的C端53个氨基酸足以抑制INF1诱导的细胞坏死,而删去C端的最后12个氨基酸后的Avh238突变体丧失了抑制INF1诱导的细胞坏死的功能,表明效应分子Avh238的C端是其抑制INF1诱导的坏死的关键区域。通过在烟草上瞬时表达或者在辣椒疫霉中过表达Avh238并接种疫霉菌的实验,进一步证实其促进疫霉侵染的毒性功能。另一方面,通过CRIPSR/Cas9介导的基因原位替换,本研究成功获得了用Avh238P7076替代Avh238P6497的大豆疫霉转化子,并发现Avh238P6497诱导植物细胞死亡的能力对其发挥毒性功能没有显著贡献,揭示了Avh238的毒性功能与其诱导细胞死亡是区分开的。Avh238毒性靶标筛选及互作机制研究。通过在烟草叶片上瞬时表达Avh238,继而利用体内Co-IP和LC-MS/MS等技术,筛选得到了 Avh238的候选靶标蛋白1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACS)。Pull-down和Co-IP实验验证了 Avh238和GmACS的互作关系。ACS是植物合成乙烯的限速酶,对乙烯合成至关重要。本研究发现Avh238能够与大豆的ACS互作并使ACS蛋白水平不稳定,进而影响疫霉侵染过程中的乙烯合成,促进疫霉菌侵染。本研究发现ACS和乙烯是植物抵抗大豆疫霉的正调控因子,沉默大豆的ACS显著促进大豆疫霉的侵染,过表达ACS、施加乙烯类似物乙烯利或者乙烯前体ACC均能显著提高植物对大豆疫霉的抗性。此外,相对于野生型大豆疫霉而言,突变了 Avh238后的大豆疫霉转化子抑制侵染过程中产生乙烯的能力显著下降,并且其侵染能力亦显著降低。本研究揭示了乙烯合成及信号传递通路是植物抵抗大豆疫霉的关键途径,而大豆疫霉能够利用Avh238来攻击植物乙烯相关的防御体系从而促进自身侵染。Avh241的靶标筛选及相关机制研究。通过在烟草叶片上瞬时表达Avh241,结合体内Co-IP技术和蛋白质组筛选,得到了 Avh241在烟草中的靶标蛋白NDR1(non-race-specific disease resistance 1)。Co-IP 实验验证了 Avh241 和 NbNDR1、GmNDR1-1、GmNDR1-2的互作关系。共定位实验表明Avh241和NDR1共定位与植物细胞膜上。在烟草上沉默NDR1后检测Avh241诱导植物细胞死亡的活性,发现Avh241诱导的植物细胞死亡不依赖于NDR1,暗示NDR1可能参与到Avh241的毒性功能过程中。文献报道拟南芥NDR1能够与RIN4蛋白结合,从而参与调控无毒基因与抗病基因的识别,我们推测Avh241是否能够通过干扰这一过程从而影响植物的ETI。结果表明Avh241并不能影响大豆GmNDR1与GmRIN4的结合。在烟草叶片上过表达NDR1并接种辣椒疫霉,发现其能够正调控烟草对辣椒疫霉的抗性,表明NDR1在植物抗疫霉过程中发挥了重要作用。进一步研究发现NDR1能够通过形成二聚体从而发挥功能,而Avh241能够通过干扰NDR1二聚体的形成,从而发挥其毒性功能,促进疫霉菌的成功侵染。


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