农杆菌介导的白菜类作物转基因体系建立及WRKYⅡa转录因子蛋白互作验证

【摘要】：Rapid-cycling Brassica rapa(RCBr)是一类株型矮小、连续光照条件下生命周期约为40天的白菜类植物,被大量用于生物学教学,但关于其遗传转化的成功案例仍未见报道。由于蘸花法被广泛用于转基因拟南芥的获得,真空渗透法可用于进行‘四九菜心’的遗传转化,本研究对三种不同生长时期的RCBr进行了农杆菌介导的真空渗透或蘸花处理,结果均获得了 GFP阳性植株,总计转化率为0.1%(1株每1000颗T1种子)。此外,还对转化株进行了 PCR和Southern印迹杂交实验的验证。RCBr遗传转化系统的成功建立,将促进新的生物学教学工具的发展和对白菜类植物的基础生物学研究。WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物病害防御反应中发挥了重要作用。根据拟南芥WRKY Ⅱa转录因子氨基酸序列和已有的白菜WRKY基因家族分析结果,对不结球白菜WRKY Ⅱa转录因子进行克隆,结果发现共有六个基因,将新发现的两条序列分别命名为BcWRKY98和BcWRKY104。通过进化树分析发现,BcWRKY1、BcWRKY18 和 BcWRKY60 与 AtWRKY18 同源,BcWRKY40、BcWRKY98和BcWRKY104与AtWRKY40同源。霜霉病菌侵染实验发现,在抗病品种‘苏州青’中,WRKY Ⅱa转录因子的相对表达量在48hpi上升、72hpi下降。因此,了解WRKY Ⅱa转录因子的功能有助于不结球白菜抗病育种的发展。通过酵母双杂交实验发现,不结球白菜WRKY Ⅱa转录因子间存在复杂的互作关系。以BcWRKY1为诱饵进行酵母双杂交文库筛选发现,部分候选蛋白参与植株信号转导和逆境响应。考虑到蛋白功能冗余的问题,构建了靶标为一个或多个WRKY Ⅱa基因的CRISPR/Cas9载体,并进行了白菜转化。尽管在获得的转基因白菜中靶标基因位点没有发生突变事件,但转基因植株仍表现出异于野生型材料的表型,因此说明转基因白菜中发生了 T-DNA插入突变。以具有异常表型的转基因白菜DNA为模板,使用TAIL-PCR分别对T-DNA左、右侧翼序列进行扩增并测序,发现在FPsc转基因材料IIaG-1中,基因Brara.F03841的3’端为T-DNA的一个插入位点。