Streptomyces albospinus CT205诱变育种及在芹菜根腐病防控中的应用

【摘要】：生防菌高效价的产素水平是研发新型土传病害生物制剂的重要指标。白刺链霉菌(Streptomycesalbospinus)CT205是一株重要的生防菌株,其代谢产生的抗生素为环己酰亚胺(Cycloheximide),环己酰亚胺在医学研究上用作蛋白抑制剂,在农业上可应用于农业病虫害防控。本文通过诱变筛选及发酵条件优化等手段提高其产素性能,比较研究诱变菌株与野生菌株产生复合挥发性物质(VOCs)的差异,探讨菌株CT205代谢产物对植物系统抗性的影响,最后利用诱变菌株制备生物菌剂用于芹菜根腐病防控。主要研究结果如下:1.通过吖啶橙、微波、UV以及UV-LiCl四种诱变育种方法获得124株突变株,经酵母菌拮抗圈初筛、液体摇瓶复筛、含量稳定性测试后,获得一株产环己酰亚胺正突变株U-L-4。环己酰亚胺含量由27.0 mg/L提升至42.0mg/L。为进一步提高突变菌株产环己酰亚胺含量,使用单因素试验对突变菌株U-L-4进行液体发酵条件优化。优化后诱变菌株U-L-4液体发酵配方(g/L):甘露醇50g、蛋白胨 2g、CaCO33.0g、NaCl 2.0g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 0.5 g;培养基初始pH为7.5,装液量50/500 mL,接种量10%,28℃发酵5 d,发酵液中环己酰亚胺含量达64.22 mg/L,较野生菌株提高了 140.74%。比较了环己酰亚胺测定方法,结果发现高效液相色谱法(HPLC)、生物活性法和分光光度法3种方法均对环己酰亚胺标准品呈现较好的线性关系,其中相关系数R2HPLC法(0.9992)R2生物活性法(0.9937)≈R2分光光度法(0.9965)。HPLC 法及生物活性法适合测定CT205发酵液及粗提物中活性物质含量,分光光度法不适用于检测发酵液等杂质含量较多的样品。2.经吖啶橙诱变获得的诱变菌株AO-9对指示菌的抑菌活性大于野生菌株CT205,但环己酰亚胺含量却低于CT205,推测野生菌株经诱变后VOCs可能发生了差异。结果发现诱变菌株U-L-4、AO-9产生的VOCs较野生菌株CT205能更显著地抑制黄瓜尖孢镰刀菌菌丝生长及孢子形成,且菌株U-L-4作用大于菌株AO-9。通过GC-MS检测对比诱变菌株U-L-4、AO-9与野生菌株CT205产VOCs差异,发现诱变菌株AO-9、U-L-4较野生株CT205产生的醇类(2-甲基异冰片等)、烯烃类物质(2-甲基-2-冰片)显著增加,其中诱变株AO-9、U-L-4产烯烃类物质较野生株CT205分别增加了 40.71%、32.47%;产醇类物质较野生株CT205分别增加了 1.10%、0.63%。佛术烯及(-)-β-蒎烯均具有较强的抑菌活性,诱变株AO-9、U-L-4产生佛术烯及(-)-β-蒎烯较野生株CT205分别增加了6.75%、0.25%。研究结果证实了突变菌株AO-9对指示菌抑菌圈大,环己酰亚胺产量低于野生型菌株的原因,是具有抑菌活性的挥发性物质含量提高了。3.探究白刺链霉菌CT205产生的活性物质环己酰亚胺及VOCs对黄瓜植株防御系统的影响。结果表明:在处理12 h时,25 mg/L环己酰亚胺、复合VOCs、环己酰亚胺+复合VOCs、BTH等各处理苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)酶活性显著高于对照,分别提高179.56%、35.35%、95.57%、83.14%;及 86.16%、77.57%、97.10%、99.49%。处理 24 h 时,各处理多酚氧化酶(PPO)酶活性显著高于对照处理,分别提高了 28.82%、33.09%、17.28%、79.19%。处理96 h时,各处理超氧化物歧化酶(SOD)酶活性显著高于对照处理,分别提高11.72%、412.25%、122.97%、57.42%。处理后黄瓜叶片中水杨酸含量较对照均显著增加,其中环己酰亚胺+复合VOCs处理96 h达最高值0.3729 μg/g,比对照提高了 9.8倍。初步说明菌株CT205产生的活性物质在一定程度上能诱导黄瓜产生系统抗性。4.按细土与沙:麦麸:花生饼:椰糠:小米:肉骨粉=4:2:1:1:1:1进行配比制备突变菌株U-L-4固体发酵菌剂,培养14d,活菌数达8.0×108 CFU·g-1。芹菜田间应用发现植株根际土壤病原真菌数量显著降低,芹菜亩产较对照提高75%,该菌剂在防治病害的同时有一定的促生作用。