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重度限饲诱发妊娠后期湖羊母子肝脏脂质代谢紊乱和氧化应激的机制

薛艳锋  
【摘要】:绵羊妊娠后期采食不足严重威胁母子健康,但此时绵羊母子肝脏脂质代谢稳态变化和氧化应激状况尚不清楚。本论文以重度限饲诱发妊娠后期湖羊能量负平衡为动物模型,基于转录组学和代谢组学等技术手段,研究了重度限饲对妊娠后期湖羊母子肝脏脂质代谢稳态和氧化应激的影响与机制。具体内容如下:1.重度限饲对妊娠后期湖羊母体肝脏脂质代谢的影响研究本章旨在研究重度限饲对妊娠后期湖羊母体肝脏脂质代谢的影响。试验选用妊娠115天、怀双羔或多羔且体况接近的纯种湖羊20只,随机分成两组,对照组按照预饲期计算的采食量正常饲喂全混合日粮,处理组限饲至30%,每隔5天采集血液样品,检测生化指标。处理15天后,屠宰并采集湖羊母体肝脏样品,进行形态学和代谢组学分析。结果显示,与对照组相比,处理组湖羊血液中β-羟丁酸(BHBA)、非酯化脂肪酸(NEFAs)和胆固醇含量升高(P0.05),葡萄糖含量降低(P0.05)。对肝脏形态结构分析表明,重度限饲导致湖羊的肝脏肿大、色泽蜡黄,肝细胞内外分布着大量的脂肪滴,细胞核、线粒体和内质网损伤。重度限饲组湖羊的母体肝脏中NEFAs、BHBA、胆固醇和甘油三酯含量升高(P0.05),甘油含量降低(P0.05)。代谢组学分析的结果显示,重度限饲组母体肝脏整体代谢谱发生明显变化,差异代谢物(DMs)主要归类于脂肪酸和脂质,且其含量高于对照组(P0.05)。DMs通路富集分析表明,肝脏脂肪酸代谢和磷脂质代谢发生明显变化。以上结果表明,重度限饲改变了妊娠后期湖羊母体肝脏代谢稳态,导致其肝脏中脂肪酸和脂质含量增加,同时肝脏形态发生变化,肝细胞内部结构受到损伤。2.重度限饲诱发妊娠后期湖羊母体肝脏脂质代谢紊乱的机制研究本章旨在研究重度限饲诱发妊娠后期湖羊母体肝脏脂质代谢紊乱的机制。试验同1,试验结束时,采集湖羊母体肝脏样品,抽提RNA,用于转录组学和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。结果显示,与对照组比较,处理组湖羊母体肝脏的整体转录谱发生明显变化。差异基因(DEGs)的KOG功能分类显示,DEGs主要归类为脂质的转运与代谢。与对照组比较,处理组湖羊肝脏中与脂肪酸转运、结合和氧化和甘油三酯降解相关DEGs的表达上调(P0.05),与脂肪酸合成、胆固醇合成和磷脂降解与合成相关DEGs的表达多数下调(P0.05)。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,处理组湖羊肝脏中脂肪酸氧化关键酶基因的表达上调(P0.05),胆固醇和酮体生成关键酶基因的表达下调(P0.05),甘油三酯合成关键酶基因的表达上调(P0.05)。KEGG通路富集分析表明,DEGs显著富集在视黄醇代谢和PPAR信号通路(P0.05)。相关性分析结果显示,母体肝脏中PPAR信号相关DEGs的相对表达与NEFAs含量呈正相关(P0.05),视黄醇代谢相关DEGs的相对表达与BHBA含量呈负相关(P0.05)。以上结果表明,在湖羊妊娠后期,重度限饲引起母体肝脏脂质代谢相关通路的基因表达发生改变,诱发脂肪酸氧化加强,胆固醇和酮体生成受阻,甘油三酯合成加强;PPARA/RXRA信号通路发生改变。3.PPARA/RXRA信号通路在湖羊肝细胞脂质代谢过程中的调控机制研究本章旨在研究PPARA/RXRA信号通路在湖羊肝细胞脂质代谢过程中的调控作用。从新生羔羊肝脏中分离原代肝细胞,分别使用不同浓度的NEFAs和BHBA以及PPARA和RXRA的激活剂匹立尼酸(WY)和9-顺式视黄酸(RA)处理肝细胞,研究PPARA/RXRA信号通路以及脂质代谢关键酶基因和代谢产物的变化。结果表明,与对照组比较,NEFAs可上调肝细胞中的PPARA以及脂肪酸氧化、酮体生成和甘油三酯合成关键酶基因的表达(P0.05),提高处理组肝细胞中的BHBA、胆固醇和甘油三酯的含量(P0.05)。BHBA可下调肝细胞中的RXRA以及脂肪酸氧化和酮体生成关键酶基因的表达(P0.05),上调甘油三酯合成关键酶基因的表达(P0.05),增加NEFAs、胆固醇和甘油三酯的含量(P0.05)。使用WY和RA可上调肝细胞中的PPARA和RXRA以及脂肪酸氧化和酮体生成关键酶基因的表达(P0.05),降低甘油三酯合成关键酶基因的表达(P0.05),降低NEFAs水平(P0.05),升高BHBA水平(P0.05)。以上结果表明,NEFAs可激活湖羊肝细胞中的PPARA信号,促进脂肪酸氧化和酮体生成;而BHBA可抑制RXRA信号,抑制脂肪酸氧化和酮体生成;激活PPARA/RXRA信号通路可增强脂肪酸氧化和酮体生成,减少甘油三酯合成。4.重度限饲对妊娠后期湖羊胎儿肝脏代谢稳态的影响及其机制研究基于转录组学和代谢组学联合分析,研究了重度限饲对妊娠后期湖羊的胎儿肝脏脂质代谢的影响及机制。试验同1,试验结束时,采集湖羊胎儿肝脏样品,用于形态学、转录组学、代谢组学和qRT-PCR分析。结果显示,与对照组比较,处理组湖羊胎儿的体重和肝脏重量皆显著降低(P0.05),胎儿肝脏中NEFAs含量升高(P0.05),胆固醇含量降低(P0.05),大量脂肪滴在肝脏中累积,肝细胞核受到挤压而变形。转录组分析结果显示,处理组湖羊胎儿肝脏的整体转录谱发生明显变化,KOG功能分类显示,DEGs主要富集于物质代谢中脂质转运与代谢这一类别。与对照组相比,处理组湖羊的胎儿肝脏中脂肪酸氧化和酮体生成关键酶在基因和蛋白水平上的表达上调(P0.05);脂肪酸、类固醇和胆固醇合成关键酶基因的表达下调(P0.05);甘油三酯降解酶基因的表达下调(P0.05),而合成酶基因的表达上调(P0.05);磷脂降解和合成的关键酶基因的表达下调(P0.05)。代谢组分析结果显示,两组间胎儿肝脏的DMs绝大多数归类于脂肪酸和脂质。DMs的通路分析显示,DMs在甘油磷脂质代谢通路中显著富集(P0.05)。以上结果表明,在湖羊妊娠后期,重度限饲引起胎儿肝脏脂质代谢紊乱,脂肪酸氧化、酮体生成和甘油三酯合成加强,脂肪酸与固醇的合成以及磷脂的降解与合成减弱。5.重度限饲诱发妊娠后期湖羊母子肝脏氧化应激及其调控机制研究采用体内外试验,研究了重度限饲对妊娠后期湖羊母子肝脏的氧化应激应答的影响及其诱导调控机制。试验同1,每隔5天采集血液,试验结束后屠宰所有湖羊,采集母体和胎儿肝脏样品,检测氧化和抗氧化指标。结果显示,与对照组相比,处理组湖羊的血液、母体肝脏和胎儿肝脏中氧化指标包括过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)的含量升高(P0.05),而抗氧化指标包括过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及总抗氧化能力(TAC)下降(P0.05)。重度限饲导致母体和胎儿肝脏中多数抗氧化相关基因的表达显著下调(P0.05)相关性分析表明,湖羊母体和胎儿肝脏中的氧化应激指标与NEFAs和BHBA水平显著正相关(P0.05),抗氧化指标与NEFAs和BHBA水平显著负相关(P0.05)。在此基础上,从新生羔羊肝脏中分离原代肝细胞,分别使用不同浓度的NEFAs和BHBA以及PPARA和RXRA的激活剂WY和RA处理肝细胞,研究氧化和抗氧化相关指标的变化。结果表明,高浓度NEFAs提高了肝细胞中的H2O2和MDA含量(P0.05),降低了 TAC及CAT和SOD的活性(P0.05);高浓度BHBA增加了 H2O2和MDA含量(P0.05),降低了 TAC及SOD活性(P0.05)。用WY和RA激活PPARA/RXRA信号通路,降低了 H2O2和MDA含量(P0.05),升高了 TAC含量(P0.05)。以上结果表明,妊娠后期重度限饲引起的湖羊母体和胎儿肝脏的脂质代谢紊乱,导致NEFAs和BHBA含量升高,进而降低了湖羊的抗氧化能力,诱导氧化应激,而激活PPARA/RXRA信号通路可增强抗氧化能力,缓解氧化应激。综上所述,重度限饲可引起妊娠后期湖羊母子肝脏中脂质代谢紊乱,诱发母子肝脏产生氧化应激,进而抑制胎儿肝脏乃至全身的生长发育。PPARA/RXRA信号通路受NEFAs正调控,受BHBA负调控,激活肝细胞中PPARA/RXRA信号通路可减轻脂质代谢紊乱,缓解氧化应激。


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