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拟南芥T-SNARE蛋白SYP31/SYP32和COG栓系复合体亚基COG5在雄配子体发育中的功能研究

芮庆臣  
【摘要】:雄配子体发育是被子植物进行有性生殖的关键过程之一,雄配子体发育要经历花粉内壁的形成、花粉第一次有丝分裂时期细胞板的形成以及花粉管的生长等关键步骤,在这些发育过程中,细胞壁物质的合成和运输发挥关键的作用。在植物中,高尔基体内蛋白运输和高尔基体形态维持的分子机制及其在拟南芥生长发育过程中的功能并不清楚。本论文运用生物化学、细胞生物学和遗传学等手段对高尔基体定位的两种蛋白:T-SNARE蛋白SYP31/SYP32以及COG拴系复合体COG5亚基的生物学功能及其分子机制进行了深入研究。本文研究内容分为两部分:第一部分:SYP31/SYP32在雄配子体发育过程中的功能研究已有的文献表明SYP31/SYP32在酵母和哺乳动物中的同源蛋白SED5/Syntaxin5参与高尔基体内的反向运输。与此一致,拟南芥SYP31和SYP32定位于高尔基体,并且SYP31特异地定位于顺面高尔基体,原生质体中过表达SYP31抑制内质网和高尔基体之间的蛋白运输。SYP31在细胞板的定位暗示其可能参与胞质分裂的过程,但是SYP31和SYP32在植物生长发育中的功能并不清楚。本论文的第一部分为SYP31/SYP32在雄配子体发育过程中的功能研究,主要研究结果如下:1.拟南芥SYP3家族在雄配子体发育过程中的重要功能序列比对结果显示SYP31和SYP32具有保守的蛋白功能域,转录组测序数据、GUS染色以及荧光定量PCR分析结果均表明SYP31和SYP32在花粉中大量表达,暗示二者之间可能存在功能冗余。为了研究它们之间的遗传互作关系,我们通过将syp31和syp32突变体杂交获得syp31/+;syp32/+双突变体,并利用单/双突变体进行回交实验发现,syp31 syp32双突变的雄配子体无法传递。与此一致,syp31/+;syp32/+双突变体花药中有约22%的花粉败育,而野生型和单突变体中败育花粉的比例均小于1%。说明SYP31和SYP32在花粉的发育过程中具有重要功能。2.SYP31和SYP32基因的双突变破坏了花粉高尔基体的形态,导致花粉细胞板生长、内壁成分沉积的缺陷以及胼胝质异常堆积DAPI染色结果表明syp31 syp32双突变花粉在一核期和二核期之间开始发育异常。透射电镜分析结果显示双突变体一核期花粉中高尔基体呈现潴泡变短、肿胀等现象,突变体二核期花粉高尔基体垛叠的完整性被破坏,含有潴泡的数量减少,且潴泡的长度变短。苯胺蓝染色结果表明花粉PMI时期细胞板的形成缺陷,花粉在二核期有大量胼胝质异常堆积的现象。电镜观察结果显示二核期花粉内壁形态异常,内壁物质分布不均匀。半薄切片的Calcoflour white染色结果表明syp31 syp32-1双突变花粉内壁的纤维素成分无法正常沉积,这些结果表明SYP31与SYP32参与高尔基体的形态维持,并在花粉细胞板和花粉内壁的形成过程中发挥功能。3.SYP31/SYP32参与调控高尔基体蛋白的驻留以及果胶的外泌高尔基体驻留蛋白EMP12在syp31 syp32双突变体花粉中错误地定位到液泡膜和液泡腔,暗示COPI囊泡运输的缺陷。在串联亲和纯化(GS-TAP)实验中,在SYP31和SYP32共纯化的蛋白中鉴定到大量的COPI衣被复合体组分,更进一步表明SYP31/SYP32参与介导COPI囊泡的运输过程。高度甲酯化的果胶在高尔基体上合成,然后通过细胞外泌作用运输到花粉质膜外,参与内壁的形成。JIM7免疫荧光结果显示,高度甲酯化的果胶在syp31 syp32双突变花粉内大量堆积,说明携带果胶的外泌囊泡运输的速率和准确性受到影响。4.SYP31/SYP32与COG拴系复合体相互作用在拟南芥PSBD细胞中表达GS-SYP31和GS-SYP32,利用GS-TAP结合质谱分析,我们鉴定到了分别与SYP31和SYP32共纯化的蛋白,其中包括COG拴系复合体。通过酵母双杂交、体内免疫共沉淀、荧光素酶互补成像以及GST pull-down实验,我们进一步验证了 COG3与SYP31和SYP32的相互作用。烟草表皮瞬时表达SYP31和SYP32均与COG3共定位,并且在syp31 syp32花粉中COG3失去高尔基体定位而弥散到胞质中,暗示SYP31和SYP32可能具有招募COG3的功能。之前报道拟南芥COG复合体亚基cog3和cog8突变体花粉中,高尔基体的形态异常,表现出潴泡变短、肿胀等表型,与syp31 syp32-1双突变花粉中观察到的高尔基体表型类似。而且与syp31 syp32花粉类似,cog3和cog8突变体中γ-COP失去了与高尔基体的紧密联系,暗示SYP31/SYP32与COG3共同调控高尔基体内COPI囊泡介导的反向运输。第二部分:COG5在花粉管生长过程中的功能研究1.COG5突变导致花粉管生长缺陷GUS染色结果表明COG5在花粉中大量表达,回交实验发现cog5雄配子体无法传递,DAPI染色、亚历山大染色以及扫描电镜观察分析结果表明其在小孢子发生和成熟的过程中与野生型相比没有明显的缺陷。在花粉体外萌发和花粉管生长实验中,cog5/+突变体中发现有生长短小或爆裂的花粉管,并且统计结果显示这些异常的花粉管比例明显高于野生型。免疫荧光和组化染色分析表明,cog5花粉管中细胞壁成分沉积异常。2.COG5突变导致高尔基体形态异常和高尔基体marker蛋白的错误定位cog5突变花粉中EMP12荧光信号呈现出圆点状,暗示其高尔基体形态的改变,透射电镜观察结果显示,cog5-1突变体的高尔基体潴泡长度变短。另外,在突变花粉中形态异常的高尔基体周围可以看到大量囊泡堆积。cog5突变花粉中大部分ERD2荧光信号呈现出网状结构,其形态与内质网类wny,因此COG5突变导致ERD2错误地定位到内质网中。这些结果说明COG5突变导致高尔基体形态改变和高尔基体marker蛋白的错误定位。3.COG5与β-COP以及组成型激活态的RabD2B相互作用通过酵母双杂交筛库,我们鉴定到了与COG5相互作用蛋白β-COP与RabD2B。通过免疫共沉淀、双分子荧光互补实验以及体外GST-pull down实验我们进一步验证了 COG5与β-COP的相互作用,并且双分子荧光互补实验结果显示COG5与β-COP的相互作用位置在高尔基体。cog5突变花粉中β-COP的荧光信号虚弱且模糊,周围的背景荧光信号增强且有微小的点状分布,这可能是由于COPI囊泡无法在高尔基体进行栓系和融合导致的。利用点突变构建了激活态和失活态的RabD2B酵母表达载体,酵母双杂交、荧光素酶互补成像技术以及体外GST-pull down实验结果表明COG5与激活态RabD2B相互作用,暗示其可能作为RabD2B的下游效应因子参与高尔基体蛋白运输。本研究中发现,透射电镜下cog5突变体花粉中高尔基体潴泡变短等表型,与之前报道的cog3和cog8以及我们在syp31 syp32-1双突变花粉中观察到的高尔基体表型类似;在这些不同突变体的花粉中γ-COP失去了与高尔基体的紧密联系;COG5与β-COP之间以及COG3与SYP31/SYP32之间直接相互作用。这些结果表明SYP31/SYP32与COG复合体协同参与调控COPI囊泡介导的高尔基体内反向运输及高尔基体形态结构的维持,并在拟南芥雄配子体的发育过程中发挥功能。


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