吡蚜酮的生殖毒理与抗性机制研究

【摘要】：褐飞虱是危害我国以及其他亚洲国家水稻上的主要害虫之一,由于其有远距离迁飞习性、繁殖能力强,每年直接造成我国水稻产量减少约120万吨。目前,对于褐飞虱的防治以化学药剂为主,但随着杀虫剂长期以及大规模的使用,褐飞虱对大多数杀虫剂都产生了抗性。2009年,由于氟虫腈对蜜蜂的高毒问题而禁止在稻田使用,吡蚜酮成为防治褐飞虱的首选药剂,它在田间速效性较差,但持效期长,对褐飞虱的控制效果可达月余。但随着该药剂的大量使用,室内监测结果发现2012年褐飞虱对吡蚜酮已产生高水平抗性,田间防效也明显下降。与多数商品化杀虫剂不同,吡蚜酮的作用靶标(Nanchung-Inactive蛋白复合体)直到2015年才被发现,但吡蚜酮具体的毒理机制尚不完善。此外,又是何种抗性机制参与了褐飞虱对吡蚜酮的抗性?这些问题都有待进一步的研究。为回答上述问题,我们首先开展了吡蚜酮的生殖毒理机制与抗性机制研究,研究结果如下:一、吡蚜酮的生殖毒理机制吡蚜酮作为当前褐飞虱防治的主要药剂,在田间表现出可减少褐飞虱下代种群数量的效果,但吡蚜酮抑制害虫种群数量的具体毒理机制不详。本章首先利用杀虫剂抗性行动委员会(IRAC)推荐的No.005方法证实吡蚜酮可以抑制褐飞虱的生殖力,经吡蚜酮处理的褐飞虱后代数量明显下降,随着吡蚜酮浓度的升高,抑制效果也随之增加,呈现出一定的剂量效应。为了明确吡蚜酮是如何影响褐飞虱生殖的,我们研究了吡蚜酮对褐飞虱生殖的主要阶段交配和产卵的影响。我们系统观察了褐飞虱的交配行为,将其分为8个步骤:振腹、追随、定位、振翅、尝试交配、交配、结束交配和离开。分析吡蚜酮处理后褐飞虱的交配行为可以看出吡蚜酮不仅可以干扰83.3%雄性飞虱的追随行为,还可抑制76.7%雌性飞虱的腹部振动,表明吡蚜酮可影响褐飞虱的正常交配。此外,已交配的雌性褐飞虱,经吡蚜酮处理后其产卵量也显著下降,仅为对照组的42%。为进一步明确吡蚜酮的分子靶标在其生殖毒理中的作用,我们观察了吡蚜酮对模式昆虫黑腹果蝇的影响,发现在吡蚜酮处理后,与野生型果蝇相比,nan36a突变体果蝇雄性的求偶指数、雌性的接受能力和产卵量均明显下降。而当我们将褐飞虱NlNan基因在nan36a突变体果蝇中异源表达后,突变体果蝇的生殖行为缺陷得到恢复,再次用吡蚜酮处理,又可以再次干扰其生殖行为。该结果证实吡蚜酮通过干扰交配和产卵来降低昆虫后代数量,同时也表明NlNan基因在褐飞虱生殖行为中起着至关重要的作用,由此推测吡蚜酮可通过作用于NlNan进而影响褐飞虱的生殖行为。二、褐飞虱对吡蚜酮的靶标抗性机制研究由于吡蚜酮独特的杀虫活性,在褐飞虱对吡虫啉产生抗性后成为褐飞虱防控的当家品种。随着吡蚜酮的大规模使用,2012年室内稻茎浸渍法监测到吡蚜酮对褐飞虱田间种群7天的效果降低10倍以上,2013年后相同剂量处理试虫7天几乎全部存活,表明田间种群褐飞虱已对吡蚜酮产生抗性。本章从寻找吡蚜酮的靶标TRPV通道的突变入手,试图探究褐飞虱对吡蚜酮的靶标抗性机制。首先,我们对抗性、敏感及田间种群褐飞虱的吡蚜酮作用靶标(NlNan与NlIav基因)进行了克隆,通过比对靶标基因序列,发现NlNan基因上有一个氨基酸替换(R504Q,编码区第504位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺)。敏感品系中该位点的突变频率为0,吡蚜酮抗性筛选品系与其他田间种群均发现该突变。且吡蚜酮筛选品系褐飞虱在用吡蚜酮进一步筛选后,NlNan-504Q纯合突变频率由20.83%上升至43.24%,预示该突变可能与吡蚜酮的抗性有关。为了进一步验证褐飞虱NlNan-504Q是否参与对吡蚜酮的抗性,我们将NlNan-504R或者NlNan-504Q与NlIav一同在爪蟾卵母细胞中进行体外共表达,通过电生理技术测定了吡蚜酮刺激后NlNan-504R与NlNan-504Q的电流差异,结果表明它们的EC50分别是55 nM(33-91 nM)和95 nM(52-170 nM),二者差异不显著,即该突变在体外不参与吡蚜酮的抗性。我们进一步利用遗传学手段分别将褐飞虱NlNan-504R与NlNan-504Q在黑腹果蝇nan36a突变体内进行了体内表达,分析吡蚜酮对两种果蝇负向地性的影响,结果显示吡蚜酮对NlNan-504R与NlNan-504Q的IC50值分别是10.18μM和9.12μM,二者间差异不显著。由此体内和体外结果均表明,尽管吡蚜酮抗性筛选品系和田间种群褐飞虱对吡蚜酮产生了抗性,但NlNan-R504Q不介导褐飞虱对吡蚜酮的靶标抗性,而仅是一个单核苷酸多态性。三、抗吡蚜酮褐飞虱种群的转录组分析在作用靶标突变检测过程中,虽然发现了 一个突变位点NlNan-R504Q,但转基因果蝇体内表达以及爪蟾卵母细胞体外表达技术均证实该突变位点并不参与褐飞虱对吡蚜酮的抗性,但吡蚜酮对褐飞虱的短期控制效果却明显下降,因此必然存在其它的抗性机制。转录组学的发展为杀虫剂抗性机制的研究提供了新的思路,为了明确褐飞虱对吡蚜酮的抗性机制,我们对褐飞虱敏感品系、吡蚜酮筛选品系以及2018年采集的2个田间吡蚜酮抗性种群进行了高通量测序。原始测序数据经过滤后,reads的测序错误率低至0.03;约97%的样品数据碱基识别率高达99%;各个样品的GC含量保持在45%。通过皮尔森相关性和主成分分析,我们发现不同种群褐飞虱样品组内具有很好的重复性,组间具有明显的差异性,这些数据评估均说明转录组数据良好,达到了后续分析的要求。在差异基因筛选过程中,与敏感品系相比,吡蚜酮筛选品系中有549个基因上调和516个基因下调;上高2018种群中有438个基因上调和323个基因下调;腾冲2018种群中有471个基因上调和557个基因下调。GO和KEGG功能富集分析表明这些差异基因主要富集在代谢途径。随后通过q-PCR技术证实P450单加氧酶家族中的3个基因(CYP301B1、CYP304H1v4和CYP6CS1)溶质载体家族中的2个基因(SLC1和SLC2)、表皮蛋白家族中的2个基因(CPR95和CPR96)、酯酶家族中的1个基因以及1个未知功能基因(LOC111060640)在吡蚜酮筛选品系、上高2018和腾冲2018田间种群中过表达,该结果表明P450单加氧酶、表皮蛋白、羧酸酯酶等差异基因可能参与褐飞虱对吡蚜酮的抗性。综上所述,转录组学分析不仅描述了褐飞虱不同基因在敏感品系、吡蚜酮筛选品系、上高2018和腾冲2018田间种群中的表达情况,还为探寻参与对吡蚜酮抗性的潜在基因提供了线索。四、褐飞虱对吡蚜酮的生化抗性机制研究通过转录组分析,我们发现P450单加氧酶基因在抗吡蚜酮褐飞虱种群中表达上调,表明P450可能参与褐飞虱对吡蚜酮的抗性。因为P450解毒酶介导了很多例昆虫对杀虫剂的抗性机制,且已有报道CYP6CM1的高表达可以导致烟粉虱对吡蚜酮产生抗性。因此,本章从代谢抗性机制入手,首先评估了三种增效剂(PBO、DEM和TPP)在褐飞虱敏感品系与吡蚜酮筛选品系中对吡蚜酮的增效作用,发现多功能氧化酶的抑制剂PBO对吡蚜酮筛选品系褐飞虱的增效作用显著,增效比为2.83;DEM也有一定的增效作用(SR=1.98)。代谢酶活性测定表明吡蚜酮筛选品系褐飞虱多功能氧化酶的活性是敏感品系的1.7倍,表明褐飞虱对吡蚜酮的抗性机制可能涉及多功能氧化酶的解毒活性增强。为进一步探究哪些P450基因可能参与对吡蚜酮的抗性,我们随后通过q-PCR技术比较了褐飞虱中P450基因在mRNA水平上的表达差异。与敏感品系相比,吡蚜酮筛选品系中有13个P450基因表达上调,其中6个P450基因具有极显著差异(P0.001),它们分别是 CYP301B1,CYP304H1v4,CYP4C61,CYP4C62,CYP6CS1和CYP6ER1。CYP6CS1和CYP301B1这两个基因上调最为明显,分别是敏感品系的6.1和6.7倍。为了验证2个P450基因在吡蚜酮抗性中的作用,我们分析其在2019年田间抗性种群中的表达水平,发现CYP6CS1在南宁、韶关以及上高3个种群中也显著上调,表达水平均超过3倍,即褐飞虱可能通过提高CYP6CS1的表达量介导其对吡蚜酮的抗性。为了验证P450基因是否参与褐飞虱对吡蚜酮的抗性,我们构建了转褐飞虱P450基因果蝇,当利用GAL4/UAS表达系统将褐飞虱P450基因在黑腹果蝇中过表达后,过表达CYP6CS1的转基因果蝇对吡蚜酮的敏感性显著下降,是其对照的2.27倍;而过表达参与烟粉虱对吡蚜酮抗性的CYP6CM1的转基因果蝇对吡蚜酮的敏感性仅是其对照的1.64倍;但过表达CYP301B1的转基因果蝇的敏感性与对照无显著差异。为了进一步明确CYP6CS1在褐飞虱对吡蚜酮抗性中的功能,我们利用RNAi技术沉默吡蚜酮筛选品系褐飞虱CYP6CS1基因,发现注射dsNlCYP6CS1的褐飞虱在经吡蚜酮处理后存活率显著下降,表明CYP6CS1参与了褐飞虱对吡蚜酮的抗性。