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藻类光合作用和CCM关键酶分子定位与codA转基因烟草光合生理分析

何培民  
【摘要】: 本文主要对藻类蛋白核电镜超微结构及其主要组成成分光合作用关键酶 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(简称Rubisco)和Rubisco活化酶(Rubisco activase)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase)金相免疫分子定位和藻类CCM机制 进行了研究和探索,同时应用转基因技术把codA基因导入到烟草,并对转基 因植株在逆境下光合关键酶Rubisco活性及光合生理进行了分析。 藻类蛋白核主要由Rubisco组成,表面被淀粉鞘(starch sheath)包围, 中央有1-2条类囊体膜穿过形成纵向孔道。根据对单细胞绿藻莱茵藻、小球藻 和大型海藻条浒苔、条斑紫菜的蛋白核超微结构观察结果,可以分为3种类型; 莱茵藻蛋白核类型、小球藻蛋白核类型和紫菜蛋白核类型。并观察到蛋白核与 叶绿体基质有多处联系,蛋白核内的类囊体发生膨大,并在莱茵藻蛋白核中观 察到有数个类囊体堆积,这些细微结构功能还不清楚,可能与蛋白核行使光合 功能有关。应用原始小球藻的Rubisco抗体对几种藻类进行Rubisco Western印 迹检测和金相免疫分子定位,结果显示小球藻、条浒苔、条斑紫菜的Western 印迹图谱均为一条带,表明它们与原始小球藻的Rubisco都具有很高的同源性。 Rubisco金相免疫分子定位结果表明Rubisco主要分布于蛋白核(91-95%)和淀 粉鞘(4-8%),叶绿体基质仅有少量分布。莱茵藻和条浒苔Rubisco活化酶分子 定位结果也表明Rubisco活化酶主要分布于蛋白核表面和淀粉鞘及淀粉粒区中。 此外小球藻Rubisco全酶的分子定位也表明全酶在蛋白核的表面较多的分布, 从而进一步证明蛋白核与光合作用关系密切,并且蛋白核的光合功能可能主要 在其表面。 藻类CCM组分主要为跑外CA、叶绿体CA和蛋白核。应用莱茵藻胞外 CA抗体对莱茵藻胞外CA金相免疫分子定位,结果表明胞外CA可分布在细胞 壁内层、细胞壁与质膜之间的空间区域里,细胞壁外也有分布;应用Cah3抗体 对叶绿体碳酸酐酶Cah3分子定位,在类囊体膜上有金颗粒分布。通过对叶绿体 碳酸酐酶活性的测定,结果表明在叶绿体中存在3种碳酸酐酶:叶绿体基质中 存在1种碳酸酐酶,可被AZA抑制剂完全抑制;在膜上存在2种碳酸酐酶,1 种可被AZA抑制,1种不被AZA抑制。其中1种已被定位于类囊体膜PSII的 内侧(Park等,1999,戴新兵等,2000)。通过对莱茵藻培养液进行CO_2诱导和pH 调节对比实验;发现pH调节也可以达到使碳酸酐酶活性提高的效果。说明CO_2 诱导胞外CA产生的机制也可能是通过pH的变化起作用。 甜菜碱是盐生植物在逆境胁迫下其叶绿体将积累的一种相溶性溶质。乙酸 胆碱氧化酶(COD)可以把乙酰胆碱合成为甜菜碱。应用农杆菌感染法,通过携 带抗生素抗性基因Hyg’和i’的双元质粒载体pGAH,把COde导人到烟草中 (该cods基因前已加接了Rubisco ’J’亚基基因巾 转运肽的核昔酸序列,这样 可使COde产物在细胞质表达后,由转运肽引导进入到叶绿体中表达)。通过潮 霉素和卡那霉素已筛选到了转化烟草植株。应用PCR、Western印迹和金相免疫 电镜技术对转化植株进行了分子检测。PCR扩增产物仅为一条带,其分于大小 与设计相符,证明该code基因已整合到烟草的染色体DNA上。Western印迹鉴 定结果表明COde基因在转基因植物细胞中获得蛋白表达。应用金相免疫电镜技 术对code基因产物COD进行分于免疫定位,结果显示code基因产物COD定 位于叶绿体中,说明在COde前加接的RObiSC。小亚基的转运肽核苔酸序列在转 录和表达后形成转运肽,井引导COD进入叶绿体中表达。COde转基因植株具 有更高的抗逆性。转基因植株能在 300mM NaCI MS培养基上生长,而对照植株 却不能。把转基因技术与组织培养相结合可以快速筛选出抗性更强的植株。 对盐和高温胁迫下转基因植株的光合生理测定和分析,包括光合作用、 RZbiSC。活性、O。”和Hp含量及SOD活性等测定,其结果均表明转基因跳 比对照植株具有更高的抗盐性和一定的抗高温性。实验结果表明遵循张荣铣教 授提出的“光碳失衡”理论。即在逆境胁迫下,首先是RllbiSC。酶活性下降, 植株光造成植株光能过剩,保护酶系统活性升高,以清除自由基,当胁迫超过 一定范围时,保护酶系统活性下降,自由基 O。”及 HZO。含量急剧升高,植株的 光合功能下降,致使植株衰老及死亡。转基因植株的甜菜碱可以保护RubiSC。酶 活性,减缓“光碳失衡”程度,使植株具有更高的抗性。


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