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赖氨酸脱羧酶对水稻白叶枯病菌有机酸毒素的解毒作用及其基因的克隆和表达研究及草酸解毒菌的初步研究

吴健胜  
【摘要】: 毒素作为植物病原菌一种重要的致病生化因子,对于植物病害的形成 与发展具有重要作用。利用解毒作用对植物病害进行控制,是植物病害生 物防治的途经之一。有机酸是植物病原菌产生的一类小分子代谢产物,对 植物的生长与发育具有毒性作用。本课题针对水稻白叶枯病菌产生的有机 酸毒素,通过解毒菌或解毒酶解除或减轻其毒性,探讨它们在病害防治中 的应用价值,并评价解毒途经防治有机酸毒素介导病害的的可行性。 水稻白叶枯病菌能够产生有机酸毒素,这些毒素能够引起烟草叶片坏 死。本研究室发现:水稻白叶枯病菌能够产生解毒蛋白,该蛋白具有脱羧 酶的生化功能。根据该发现,考虑到水稻白叶枯病菌有机酸毒素底物,选取 已知基因序列的商品酶5种:精氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、谷氨酸脱羧 酶、草酰乙酸脱羧酶和延胡索酸酶,探讨它们可能的解毒作用。一定浓度 的待测酶与来源于水稻白叶枯病菌日本小种JXOⅢ菌株的毒素在合适条件 下保温一定时间后,注射接种烟草,2周后观察酶对毒素毒性的影响。结果 表明:赖氨酸脱羧酶具有明显的解毒作用,草酰乙酸脱羧酶具有一定的解 毒作用,但不够稳定,其它3种酶无明显作用。这一结果得到了进一步的 验证。 为了探讨解毒酶在防治水稻白叶枯病的应用价值,在上述研究基础上, 构建了赖氨酸脱羧酶工程菌株。以蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)染色体 为模板,用PCR方法扩增出2.2kb赖氨酸脱羧酶基因片断,将其连接在 大肠杆菌高效表达载体pTrc99A,构建重组质粒pLDC。用氯化钙法将 pLDC导入大肠杆菌HB101,从156个转化子中筛选得到重组克隆8个, 通过进一步鉴定,得到阳性克隆1个(HB101/pLD151)。HB101/pLD151 赖氨酸脱羧酶活性是蜂房哈夫尼菌原始菌株的10倍。SDS-PAGE蛋白分析 表明,HB101/pLD151表达的赖氨酸脱羧酶占细胞可溶性总蛋白的 16.5%。HB101/pLD151能够解除水稻白叶枯病菌毒素对烟草的致死作 用,能够解除水稻白叶枯病菌毒素对水稻出苗的抑制作用。本研究结果为 赖氨酸脱羧酶对水稻白叶枯病菌毒素的解毒作用提供了进一步的遗传学证 据。 重组蛋白的分子量大约为53kd,比预计的83kd小,序列分析发现: 基因表达在 1422处提前终止。进一步将截短的赖氨酸脱梭酶基因 1.4kb 片断进行了克隆、表达和功能验证。结果表明:蜂房哈夫尼菌赖氨酸脱叛 酶基因N端1.4kb片断具有完整的基因功能。 草酸在植物病原真菌作为毒素已有大量报道,但在植物病原细菌中研 究较少。采用高锰酸钾滴定法,以 Xanthomonas、Pseudomonas、R alstonla、Agrobacterium、Erwinia和 Curtobacterium 6个属为代表, 对植物病原细菌产草酸的情形进行了广泛研究,同时研究了黄单胞菌野生 型及其毒性基因突变体产草酸的差异。结果表明:植物病原细菌不同属均 能产生草酸,但在产量上存在差异。 研究发现一种细菌(编号为W八)对草酸、苯乙酸、a-甲基巴豆酸 和水稻自叶枯病菌毒素具有主物活性。W-1能消除或减轻有机酸毒素引起 烟草的坏死,解除有机酸毒素对水稻出苗的抑制、明显降低水稻白叶枯病 的病斑长度。Wd呈棒杆状,G\无芽胞,鉴定为乳酪杆菌属(Caseobacter sP.)。*P*C分析结果表明:Wd对草酸具有降解作用。结果表明:W八的 生物活性属于解毒活性。 田间试验结果表明:人工接种条件下,Wd、HB llpLD151稀释 10倍喷雾2次,对水稻白叶枯病的防病效果分别为56.4%、43%。


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