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农杆菌介导的不结球白菜抗冻基因转化体系的建立

史永红  
【摘要】: 不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)原产我国,是我国 南方地区普遍种植的大众化蔬菜,在蔬菜的周年供应中起着重要作用。但很 多不结球白菜品种在我国北方地区不能露地越冬;在长江以南地区遇到低温 也会造成冷害或冻害,影响其产量和品质。 本研究以四个不结球白菜品种为材料,研究了影响其外植体再生的若干 因素,建立了高效分化再生体系及转化体系。在按植物偏爱密码子人工合成了 昆虫抗冻肽THPI基因的基础上,构建了抗冻基因植物转化载体AP43,以农 杆菌介导法转入不结球白菜。研究结果如下: 1.不结球白菜品种间在分化条件和分化频率上存在很大差异。苏州青在 MN+TDZ2mg/L+NAA0.5mg/L+AgNO_37.5mg/L条件下,不定芽再生频率达 36.7%;AB系在MS+BA10mg/L+NAA0.3mg/L条件下分化率最高,达41.7%; 短-126,在MS+BA5mg/L+NAA0.1mg/L+Ag5mg/L条件下达36.7%;98H秋 -31与苏州青的条件相同,但分化频率不同,在MS+TDZ2mg/L+NAA0.5mg/L +AgNO_37.5mg/L条件下,分化率达42.2%。 2.对苏州青、短-126和98-H秋31,硝酸银能明显提高其子叶分化率, 而对AB系则作用不明显。加入硝酸银的浓度依品种而不同。 3.苗龄对子叶的分化率有很大的影响,6~8天苗龄范围内影响不是很大, 但苗龄大于9天和小于5天时,则分化率明显降低。 4.抗生素Km对不结球白菜子叶的分化有强烈的抑制作用。当培养基内 含sing/L的Km时,子叶不能分化形成不定芽,且愈伤白化;培养基中Km 为匕 时,不能形成愈伤。所以筛选应选用后期选择法。 5.用根.癌农杆菌介导法将 GUS基因转化不结球白莱子叶,在附加 Cb 500渺的分化培养基上进行除茵培养,30天左右可分化出不定芽,转入 附加 Cb 300mg/L和 Km 15mg/L的筛选培养基上,每 15天转接一次,筛选 2一3次后,经GU s组织化学法和Pc凡S。Utham杂交检测,表现阳性。 6构建了抗冻基因植物转化载体AP43,以农杆菌介导法转入烟草,在烟 草上进行了目的基因的功能验证;以根癌农杆菌介导法将 THP基因导入不 结球白菜,获得两株GUS阳性芽。


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