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小麦白粉病抗性相关候选基因克隆、特征分析、定位及表达研究

于玲  
【摘要】: 小麦白粉病是由白粉菌(Erysiphe graminis Dc. f. sp tritic Marchal)引起的世 界性真菌病害,控制白粉病的有效途径是培育抗性品种。南京农业大学细胞遗传 所培育的6VS/6AL易位系带有目前我国最有效的抗白粉病基因Pm21。本研究以 抗病易位系6VS/6AL及感病亲本扬五为材料,分离、克隆、分析与白粉病抗性 相关的基因,以期深入研究Pm21基因的抗病分子机制,并为最终克隆Pm21基 因奠定基础。 1.根据抗病基因保守结构域设计简并引物,并参照大麦、小麦、水稻等作物 中分离的防卫反应基因及大麦Mlo基因设计特异引物,以经白粉菌诱导后的易位 系和扬麦5号cDNA为模板进行RT-PCR筛选。共获得8个与小麦白粉病抗性相 关的侯选基因。其中,利用特异引物,从小麦中分离获得了与大麦病程相关蛋白 1、类甜蛋白及小麦β-(1.3,1.4)葡聚糖苷酶高度同源的基因序列,进一步利用RACE 技术获得了小麦病程相关蛋白1全长cDNA克隆(Ta-Prl)(GenBank登录号 AF384143),通过筛选已构建的易位系cDNA文库,获得了小麦类甜蛋白全长 cDNA克隆(Ta-TLP)(GenBank登录号AF384146);利用简并引物,从小麦 易位系cDNA中,首次分离Cyclophilin基因(Ta-Cyp)(GenBank登录号 AF384147)和H~+-ATP酶基因序列(Ta-MAH)(GenBank登录号AF384148) 以及与大麦、玉米等植物NBS-LRR抗病蛋白有极高同源性的cDNA序列(Ta- RP);根据大麦白粉病基因Mlo,设计二对特异引物。将易位系经白粉菌诱导后, 提取mRNA,并反转录成cDNA,进行PCR筛选、克隆、测序,最终获得了二 个小麦Mlo基因全长cDNA克隆(Ta-Mlo、Ta-Mlo1)(GenBank登录号AF384144、 AF384145),利用简并引物也从易位系mRNA反转录的cDNA中扩增获得了一 段与大麦Mlo蛋白高度同源的cDNA序列。对上述分离、克隆的基因进行了序列 比较研究和蛋白一级、二级结构比较分析。 2.为深入了解克隆基因是否与6VS/6AL易位系的抗病性相关,本研究将抗 病易位系及感病亲本扬5经白粉菌诱导(0,12,24,48,72h)后提总RNA,转 膜。进而对克隆的一系列基因进行了Northern杂交分析。结果表明,小麦病程相 关蛋白1基因(Ta-Pr1)及类甜蛋白基因(Ta-TLP)为诱导表达基因(非诱导对 无转录物累积),其余基因在非诱导时均有本底水平表达,但经白粉菌诱导后, 表达水平明显增强,并发现各基因在经白粉菌诱导后的抗病易位系及感病亲本杨 5中表达方式明显不同,证实分离、克隆的这些基因与易位系抗病性是相关的。 3.为研究克隆的基因在小麦基因组中的结构以及抗病易位系6VS上是否携 有这些基因,通过提取易位系,扬5、簇毛麦、簇毛麦-硬粒小麦双二倍体DNA, 进行 Southern杂交,结果表明,克隆的小麦病程相关蛋白 1 基因(TaPrl)、 CyClophilin基因(Ta-Cyp)及J麦Mlo、Mlol基因(TaMlo、TaMlol)在J麦 基因组中均为 2—3个拷贝,小麦类甜蛋白基因(Ta-TLP)为 l—二个拷贝,而小麦 卜门.3,1.川葡聚糖苦酶(TOLMZ)和H”-ATP酶基因(TUMAH)均为单拷贝。 研究发现,Ta-Prl和Ta(yp基因在扬5、易位系之间存在多态性,进一步Southern 分析证实易位系6VS上携有Ta-Cyp基因。利用中国春缺体-四体系及缺失体系, 己将Ta七 基因定位到小麦6A、6B、6D染色体上,将Ta-TLP定位到7B、7D 染色体;并将小麦Ta-Mlo基因定位到ZAL,ZBL,ZDL的特定区域上。 4.本研究进一步通过构建表达载体,使 Ta-Mlo、TaMlo及 Ta1LP基因在 大肠杆菌溶源菌 BLZI(DE/中得以表达,通过制备抗 TaMlo、TaMlo和 Ta TLP表达产物的兔抗血清,对经白粉菌诱导后的抗病易位系(6VS/6AL)和感病 亲本扬 5幼苗叶中表达的 Mlo、Mlo及 TLP蛋白进行兔疫印迹检测(western杂 交)。结果表明,小麦叶中Ta-Mlo蛋白为膜结合蛋白;并发现仅在小麦叶经白 粉菌诱导后,才能检测到该蛋白,表明Ta-Mlo蛋白为诱导表达产物。且扬5、易 位系中,该蛋白在表达时问及表达量上均存在差异,暗示M。蛋白与易位系的抗 病性是相关的。本研究中没有检测到 Ta-Mlo 的表达产物。研究发现,Ta-TLP 蛋白存在于小麦叶细胞蛋白中,其为诱导表达产生,在诱导后的扬5、易位系中 其表达量明显不同,表明该蛋白在易位系的抗病过程中有可能发挥一定作用。 5.通过田间及细胞遗传学鉴定,获得了感白粉病的小麦.簇毛麦6V缺失附加 系*n=44)Nel石Vs2X通过 C分带及原位杂交发现感病的 6V缺失附加系中 6V 染色体已丢失染色体短臂 46%的远侧端。利用现有的 12个小麦族第六群短臂 yLP 探针,对该材料及抗白粉病的 6V缺失附加系uel.6Vsl)材料进行 yLP比较 分析,没能找到多态性标记。需进一步寻找与之更近的分之标记,该缺失附加系材 料的发现对 PmZI基因的进一步精细定位具重要作用。


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