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根据抗病基因保守区克隆小麦抗病基因及小麦抗赤霉病基因双单倍体作图群体的构建

秦跟基  
【摘要】: 小麦白粉病和赤霉病是世界小麦生产中的严重病害。南京农业大学细胞遗 传所培育出高抗白粉病的小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系,其携有高抗白粉病基 因Pm21。研究并克隆小麦抗病基因,对控制小麦病害及研究小麦抗病的分子 机理有非常重要的意义。本研究利用植物抗病基因具有一些共同的保守区如核 苷酸结合位点(NBS),富含亮氨酸重复(LRR)和丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域的特 点,设计简并性引物通过PCR方法获得抗病基因片段,继而筛选6VS/6AL易 位系的可转化人工染色体(TAC)基因组文库,分离完整的基因。 用根据NBS,LRR和丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域设计的3对简并性引物, 以6VS/6AL易位系的基因组DNA或cDNA及簇毛麦的基因组DNA为模板进 行PCR扩增。扩增产物克隆到pGEM-T载体中,经测序,共获得具有NBS结 构域片段的克隆18个,具有LRR结构域片段的克隆3个,具有丝氨酸/苏氨酸 蛋白质激酶域片段的克隆1个。将克隆之间核苷酸序列同源性高于90%的克隆 归为一类,共分为8类。这8类抗病基因类似序列(RGAs)均具有开放阅读框, 并与已克隆的小麦抗条锈病基因Yr10,大麦抗白粉病基因Mlal和Mla6,拟南 芥的抗病基因RPS2,番茄的抗病基因Cf-2、Cf-4、Cf-5和Cf-9以及其他一些 抗病基因在保守区内具有高度的同源性。用小麦中国春缺体-四体初步将它们分 别定位于小麦第一、第二和第五部分同源群上。 根据从小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系的基因组DNA获得的一条296bp的 LRR序列设计引物,以6VS/6AL易位系的基因组DNA为模板,用TAIL-PCR 从两端延伸该片断达800bp左右。根据该序列设计了一对特异引物,分别以感 病对照扬麦5号,抗病6VS/6AL易位系,6V代换系,硬粒小麦-簇毛麦双二倍 体及簇毛麦的基因组DNA为模板进行特异性扩增。除扬麦5号未扩出带,其 他均扩出一条730bp的带。再用不同品系小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系以及其 他品种的基因组DNA为模板进行PCR,都只能在含有Pm21的易位系中扩出 730bp的目的带,而不含Pm21的品种则无扩增产物。 用克隆池PCR法用这对LRRt的特异引物筛选小麦-簇毛麦6VS/6AL易位 系的基因组TAC文库。该文库由22块96孔板组成,每孔中含有约1000个混 合的TAC克隆。为了用PCR筛选文库,首先提取这22×96个混合质粒,然后 用特异引物分级筛选,最后获得一个可能的阳性TAC单克隆。将该TAC克隆 用不同6碱基酶酶切,转膜后,以上述LRR片段作探针进行Southern杂交,每 种酶切均有杂交带,表明该克隆为真正的阳性单克隆。其中用SeaⅠ酶酶切的该 TAC克隆,仅在约4.okb处有一条杂交带。将这条带进行亚克隆后,用特异引 物分步测序,共获得 273 hp序列。 该序列编码一个含有753个氨基酸的蛋白,暂命名为7iiLKKIo用出 刀 软件在GeneBank中比较该基因的核昔酸序列,未发现有明显同源的序列,表 明该基因是一个新基因。当用BbotZ、0软件在GeneB毗中比较该基因的氨基酸 序列时,发现TaLRRI与番茄抗病垦因CfJ、o人q5和o9以及其他一些 抗病基因在保守区内具有高度的同源性。再用 ClustaIXI.巴软件将 TaLRRI的氨 基酸序列与番茄抗叶霉病基囚 CfZ和 Cf4的氨基酸序列进行多序列比较,结果 表明 TaLRRI与 CfZ和 Cf4有相似的结构。这是首次从小麦中克隆到的与双于 叶植物番茄的 CfJ和 Cf4有类似结构的细胞外受体类抗病候选基因。根据比较 结果推断TaLRRI为一个含有LRR的膜结合糖蛋白,可划分为7个区域(AAI)。 A区是可能的信号肽,B区是成熟蛋白的N-端,C区为25个LRR重复,D区 是没有明显特点的区域,E区富含带负电荷的酸性氨基酸的区域,F区由29个 不带电荷的氨基酸组成跨膜疏水区,G区富含带正电荷的碱性氨基酸的区域。 C区共有13个可能的糖基化位点N以S汀卜 用电激转化法将该TAC克隆转人农杆菌LBA4404中。从农杆菌中提取质 粒,再转入大肠杆菌,再从人肠杆菌提取质粒,然后用Hedll酶切,酶切带型 与原未的该TAC质粒完全一样,哀明该TAC质粒可以在农杆菌中稳定存在。 用该克隆转化小麦的实验正在进行中。 本研究获得的RGA序列之一N7与小麦抗条锈病基因bIO和大麦抗口粉 病基因M7dj及ABiz6分别有65o和61o的核芍酸相似性,并具有R基囚NBS 保守区。用N7的特异引物筛选6VS/6AL易位系的基因组TAC库,获得一个 抗病候选基因的TAC克隆。 小麦抗赤霉病性状山数量基因控制,遗传机制复杂。利用抗赤霉病品种苏 麦39和望水IJ,分别与感病品种Alondra’s杂交,取n代花药培养获得单倍 体绿苗。绿茁转接到炼茵培养基上在4℃冰箱中越夏。初冬移栽大田。分孽期 挖出小苗,用0.04%的秋水仙碱浴液浸根加倍。并用玉米和小麦杂交通过染色 体捎除法获得小麦单倍体。共获得能稳定遗传的双单倍体群体(DH 2个。其中 来自苏麦 3号 X Alondra’s的群体共有 102个株系,来自望水白 x Alondra’s的群 体共有153个株系。在构建DH群体时对一些影响小麦单倍体获得效率的囚素 进行了初步研究。


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