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猪链球菌2型在模型动物豚鼠体内的动态分布及基因免疫

吴全忠  
【摘要】: 用豚鼠建立了猪链球菌2型(Streptococcus suis Type 2)引致脑炎和败 血症的动物模型,研究了猪链球菌2型在动物模型体内的动态分布。并将该 菌毒力相关的溶菌酶释放蛋白基因(mrp)克隆到真核表达载体构建了真核表 达质粒,并研究其对豚鼠的免疫效果。 1 选用对猪具有致病性的猪链球菌2型江苏分离株HA9801感染豚鼠,引 致脑炎及败血症,建立了动物模型。结果显示16~24日龄的豚鼠较易感,最 佳感染途径是皮下注射,鼻腔、腹腔次之。感染豚鼠表现出典型脑炎的临床 症状及病理变化。经重复试验检测了该菌株对豚鼠的LD_(50),从感染死亡豚鼠 体内包括脑脊液、大脑、血液及各实质器官均可分离出该病原菌,与仔猪自 然感染情况相似。该动物模型的建立,为进一步探究猪链球菌2型感染的体 内动态分布、感染机制、毒力因子及免疫应答奠定了基础。 2 用猪链球菌2型江苏分离株HA9801,皮下或鼻腔接种豚鼠,检测体内 动态分布。结果显示:皮下接种后,该菌最早可于28小时到达心血,32小 时还可在肺、脾及扁桃体中分离到,32~36小时除上述器官外还见于肝、肾、 脑、脑脊液,并引发神经症状而致豚鼠死亡,接种后120小时心血和扁桃体 阳性率分别可达61.5%和69.2%。鼻腔接种同居感染表明,该菌很快传播给其 它豚鼠,第8天鼻腔拭子阳性率100%(10/10);感染豚鼠心血细菌检查结果 表明,第9天50%呈阳性,第12天70%(7/10)呈阳性。脑组织检查结果显 示,只有出现神经症状及死亡的豚鼠,才能从脑脊液和脑组织中分离到细菌, 说明细菌突破血脑屏障,是引发脑炎的前提。 3 将含有猪链球菌2型mrp基因的质粒pMR11,在大肠杆菌中表达了 136KD的该菌溶菌酶释放蛋白(MRP,muramidase-released protein),将表 达菌用超声波破碎制成的抗原,免疫豚鼠,通过免疫转印检测到MRP的特异 抗体,用PPA-ELISA对检测了血清效价;攻毒表明表达蛋白对猪链球菌2型 有一定的保护作用。 南京农业大学 博士学位论文 4用地高辛分别对猪链球菌2型的溶菌酶释放蛋白基因(mrp)和胞外蛋 白基因(epf)进行了高效标记,结果探针特异敏感,提取23株猪源涟球菌和 1株人源的猪链球菌共24株菌的MA,进行斑点杂交检测,结果mrp/mrp*和 ePf/ePf*阳性率均为 58.33%(14/24),PCR结果和 ELISA检测 MRP结果一致。 表明地高辛标记的核酸探针,可用于猪链球菌2型的分子流行病学涉调查。 5将猪链球菌2 型编码MRP的mrn基因,插入到真核表达载体 pcDNA3.1(一MccHisC质粒CMV启动于的下游,构建了真核表达质粒pCMR。应 用PCR技术能扩增出885hp的mrp基因的特异条带,通过双酶切鉴定克隆方 向正确,将该质粒用脂质体转染方法转染卯/0细胞,应用RT-PCR、免疫转 印和免疫细胞组化染色,鉴定其得到了表达,为进一步在体内研究mrp基因 的功能和作用机制奠定了基础。 6用脂质体包裹的含有猪链球菌 2型 mrp基因的真核表达质粒(pcMR) 及该菌 HA980株全菌灭活抗原,分别免疫模型动物豚鼠,肌肉注射,通过 厂PA-ELISA检测抗体的产生。免疫后,豚鼠产生MRP抗体滴度呈上升趋势; 免疫 2用后,MTT法检测脾淋巴细胞转化率(SI)、腹腔巨噬细胞吞噬活性 (AMA),基因免疫引起的细胞兔疫比全菌兔疫组强烈。兔疫后第 16天,各组 豚鼠接种 HA9801攻毒,结果显示,mro基因免疫效果虽不如全菌疫苗组,但 对豚鼠有一定的保护力,说明MRP具有一定的保护性功能


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