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抑制素被动免疫对母牛卵泡发育和生殖内分泌的影响及作用机制研究

王进荣  
【摘要】: 本文应用酶免疫测定技术、放射免疫测定技术、组织培养技术、流式细胞分类技术、蛋 白质分析技术、蛋白分离纯化技术等,以母鸡作生物反应器高效制备抑制素抗体,并确定 抑制素抗体的生物活性,用于被动免疫母牛,研究抗卵泡抑制素被动免疫对母牛生殖和内 分泌的影响,并探讨作用机制。主要内容如下: 1.抑制素α亚单位抗原肽的筛选 采用Antheprot软件分析抑制素α亚基的二级结构、疏水性、亲水性等理化特征,旨在 预测其抗原位点和抗原表位。结果表明,人抑制素α亚基有二个可能的抗原位点,分别是N 端1-26和63-82。由于N端有多个Pro,易构成coil结构,对抗原表位的形成有一定的影响, 所以人抑制素α亚基的抗原表位对能位于1-26。 2.抑制素抗体的高效制备与鉴定 用人抑制素α亚基(1-26)Gly.Tyr与KLH连接作免疫原20mg,免疫8只本地良种母鸡, 用间接ELISA法测定证明6只免疫母鸡血清和卵黄中有大量的高效价抗体。综合运用pH值、 非球蛋白沉淀法和球蛋白沉淀法,制得经纯化的抑制素抗体25640mL(蛋白质含量为 769 2g)。采用阻断ELISA法证实所获得的抑制素抗体具有高度的特异性。 将抑制素抗体被动免疫未性成熟的小白鼠、大白鼠及去势成年公羊,观察子宫及外周血 清的FSH、E_2的小平,以鉴定抑制素的生物活性。结果表明,大白鼠和小白鼠注射一次抑 制素高效抗体后,免疫组的子宫增重和外周血清的FSH、E_2的水平显著高于对照组;去势 公羊用抑制素抗体处理后可以解除卵泡抑制素对FSH的抑制作用。结果证实所制备的抑制 素高效抗体具有生物活性。 3.抑制素被动免疫母牛的体内研究 采用抑制素高效抗体被动免疫40头母牛,分析免疫后40头产后母牛的生殖内分泌和发 情排卵情况。结果表明,抑制素被动免疫后可以诱导母牛发情,从注射抗体到发情的间隔 集中在免疫后2-5天内。抑制素抗体与氯前列烯醇(PG)配伍使用后同期发情率达90%。发情 后8-12d经直肠检查发现免疫1组、2组的平均排卵数显著高于对照组,1、2组排双卵率 分别为33.3%、66.7%。抑制素抗体与氯前列烯醇配伍使用可显著提高母牛的排卵率。经放 射免疫测定法测定各激素水平的变化,发现抑制素被动免疫后,母牛外周血清FSH,E_2,IGF-1 水平升高,但差异不显著。研究结果表明抑制素抗体被动免疫对母牛没有副作用。 博土论文;抑制虽被动免疫对用牛卵泡发育和生殖内分泌的彤响及作用机制研究 4.抑制素被动免疫母牛的体外研究 在特定的体外原代培养条件下,用抑制素抗体中和牛卵泡颗粒细胞自分泌抑制素后,应 用流式细胞计数技术发现FSH促进了牛大卵泡颗粒细胞的增殖,而小卵泡颗粒细胞受到抑 制;添加抑制索抗体、PffeG、Insulin等激亲,具有增加大卵泡颗粒细胞生长的作用,而小 卵泡颗粒细胞则受到抑制;应用放射免疫测定法测定细胞培养上清巳发现在体外培养系统 添加抑制素抗体,结果在FSH的作用下,GC的&产量下降。卵丘-卵甩细胞复合体中的卵 丘层复合体(COC)颗粒细胞自分泌抑制素被抑制素抗体中和后对卵毋细胞的成熟率没有显 著影响。 在特定的原代牛颗粒细胞体外培养系统中添加抑制素抗体,去除颗粒细胞自分泌抑制 素,应用流式细胞分类技术研究其对颗粒凋亡的影响,结果表明牛的大卵泡、小卵泡颗粒 细胞存在细胞凋亡,并且本研究中各种激素处理后对大小卵泡颗粒细胞发生凋亡的比例不 同;对牛小卵泡颗粒细胞凋,只有添加 Insulin、Illsulin+AB二组凋亡比例下降,FSH、hCG 和hCG+AB均显著促进其凋亡,其他的处理均不同程度地提高了凋亡的比例;对牛大卵泡颗 粒细胞,兔疫中和去除大卵泡颗粒细胞自分泌抑制素后,细胞凋亡得到抑制。胰岛素、FSH. PMSG、FF四组凋亡细胞比例显著下降,而添加 AB、FSH H组细胞凋亡的比例显著高于对照组。


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