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小菜蛾Plutella xylostella (L.)杀虫剂靶标抗性的分子生物学研究

王建军  
【摘要】: 小菜蛾Plutella xylostella(L)是世界性的十字花科蔬菜的重要害虫,对 小菜蛾的防治主要依赖于使用有机合成杀虫剂,长期以来在其常发区己经形成 抗药谱广,抗性水平高的特点,国内外学者对小菜峨抗性机制进行了大量的研 究,然而这些研究大都局限于生物化学水平,对小菜蛾抗性的分子生物学机制 知之甚少,这无疑影响了小菜蛾抗性治理和对小菜蛾抗药性微进化现象的认 识。 本文以重要农业害虫小菜蛾为材料,对南京郊区小莱蛾进行了抗性测定。 通过增效作用测定和抗性生化机制研究发现,靶标不敏感性是南京郊区小菜蛾 对拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂产生抗性的主要机制,在此基础上,对这两杀虫 剂的作用靶标—钠离子通道和乙酰胆碱酯酶基因进行了克隆和序列分析。 抗性测定结果发现,与武汉敏感品系相比,南京郊区小菜蛾对氯氰菊酯和 溴氰菊酯产生了极高的抗性,抗性指数分别为122.04倍和大于176.64倍,对 敌敌畏和甲基毒死蜱也产生了抗性,抗性指数分别为9.54倍和22.59倍。活体 增效试验显示,酯酶抑制剂TPP对氯氰菊酯和溴氰菊酯的增效作用分别为1.46 和1,多功能氧化酶抑制剂PBO对氯氰菊酯和溴氰菊酯的增效作用分别为3.02 和1,这表明击倒抗性,即神经敏感性下降,可能是小菜蛾对拟除虫菊酯类杀 虫剂产生高抗性的主要机制。 点滴法测定结果表明阿维菌素、氟虫腈、巴丹和杀虫单对抗性小菜蛾的触 杀毒力较高,LD_(50)分别为0.003、0.0052、0.122和0.19μg/头。这4种杀虫剂 可作为今后防治抗性小菜蛾的替换药剂。杀虫剂联合毒力测定结果表明,氟虫 腈与啶虫脒、氟虫腈与阿维菌素、敌敌畏与阿维菌素、敌敌畏与杀虫单、杀虫 单与啶虫脒以及杀虫单与阿维菌素的混剂组合对抗性小菜蛾具有显著的增效 作用,共毒系数分别为288.71、215.22、206.36、215.86、232.57和642.98; 敌敌畏与啶虫脒的混剂组合对抗性小菜蛾具有拮抗作用,共毒系数为35.89; 而氟虫腈与敌敌畏、氟虫腈与杀虫单以及啶虫脒与阿维菌素的混剂组合对抗性 小菜蛾具有相加作用,共毒系数分别为115.8、94.88和112.63。 生化测定结果发现,以4龄幼虫整体匀浆为酶液,以α-乙酸萘酯为底物, 武汉敏感品系和南京抗性品系的酯酶活性分别为213.80和226.27 nmolimgPthlllll,两品系酯酶活性没有显著差异;以CDNB为底物,武汉敏感 品系和南京抗性品系的谷肌甘肽转移酶活性分别为0.9654和0.6571 0D偷gh,南京品系是武汉品系的0.68倍:以DCNH为底物,武汉敏感 品系和南京抗性品系的谷耽甘肽转移酶活性分别为0.07755和0.07992 OD/m帅in,南京品系是武汉品系的1刀3倍,没有显著差异;以对硝基苯甲 醚为底物,武汉敏感品系和南京抗性品系的多功能氧化酶卜脱甲基活性分别 为0.3806和0.4408rpol/mgPt/min,南京品系是武汉品系l.16倍,没有显著差 异。乙酚胆碱酯酶动力学研究发现,武汉敏感品系和南京抗性品系的AChE动 力学特征具有显著差异,南京品系的兄和Vo分别为武汉品系的1.57和1.37 倍。抗性生化机制研究表明,靶标不敏感性可能是南京小莱蛾对拟除虫菊酯和 有机磷杀虫剂产生抗性的主要机制。 利用反转录多聚酶键式反应(RT-PCR)的方法对小菜峨抗拟除虫菊酯品系 的钠离子通道基因cDNA片段进行了克隆和序列分析。通过特异性上游引物和 简并性下游引物从单头抗性小菜峨4龄幼虫中同时扩增出了位于钠离子通道 基因 IIS6和第H个连接区的 383hp和 3峋两个 cDNA片段,分别命名为 DBMI和 DBMZ(口沾nbthe登录号为 AF273106和 AF273107)。与小菜峨参考 敏感品系钠离子通沮基因核昔酸序列相比,编码第8位氨基酸Leu的三联密码 子的第一位碱基C突变为T,并导致Leu突变为Phe。对获得的小莱蛾钠离子 通道基因CDNA片段氨基酸序列的同源性分析表明,DBM!与果蝇pp和烟 蚜夜峨hsCp的氨基酸同源性分别为76%和84%,这表明采用的这一对引物扩 增出了与果蝇p钠离子通遭基因同源的小菜蛾钠高子通道基因cDNA片段。 DBMI与 DBMZ相比较,除了存在两个氨基酸差异外,DBMI比DBMZ多了 13个氨基酸的序列·GLKAALCGRCVSS。将CDNA片段碱基序列与通过PCR扩增获 得的对应基因组 DNA碱基序列(Genbank登录号为 AF273 105)进行比较发现, 在该区域存在长度分别为 110和 11 69hp的两个内含子。与果蝇 para $因相比, 这两个内含子的位置具有保守性。而DBMI与DBMZ则是钠离子通道基因选 择性剪接的结果,由 13个氨基酸 GLKAALCGRCVSS组成的的 39hp序列片段是一 个选择性微外元(Optiond dcroeon人进一步研究发现,在抗性和敏感小莱 2 蛾幼虫期、蛹期和成虫期的钠离子通道都存在这一选择性剪接,但DBMZ的 表达水平在不同发育阶段存在差异。 利用聚合酶链式反应,通过特异性上游引物和下游引物分别从小菜蛾武汉 敏感品系和南京拟除虫菊酯抗性品系基因组DNA中扩增出了位于钠离子通道


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