传染性支气管炎致腺胃病变毒株变异的分子基础及我国和东南亚分离株的分子流行病学研究

【摘要】： 从我国接种过传染性支气管炎疫苗的幼鸡群的腺胃组织中分离得到三个传染性支气管炎毒株Q1、J2和T3，并对它们的部分生物学特性进行研究。将病毒通过9-11日龄鸡胚，盲传5-6代。用动物回归和免疫保护试验进行了毒株的致病性研究，用气管环组织培养对病毒进行理化特征测定、毒价测定与中和试验。结果表明，SPF鸡感染后可产生高滴度的IBV中和抗体，但不能被IBV的M41血清型和澳大利亚T系的抗血清所中和，感染SPF鸡的临床症状及组织病变与野外爆发的鸡只相似，从感染鸡组织中分离到呈典型的冠状病毒样病毒粒子，用扩增IBVS1基因的引物进行RT-PCR也扩增出预期大小的DNA片段。研究证实这种以腺胃肿大为主要特征的鸡传染病的病原是传染性支气管炎病毒。 为了获得这些IBV腺胃分离毒株变异的分子生物学依据，选择IBV变异最为活跃的S1糖蛋白基因进行了分析。采用PCR法扩增出这些毒株的1.7 kb大小的完整S1基因序列。利用扩增片段两端的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点将扩增片段克隆进pBluescrip Ⅱ KS(-)载体，转化大肠杆菌JM109，挑选白色菌落并用PCR方法对插入片段进行鉴定。用双脱氧终止法对扩增的片段进行测序并与GenBank公开的序列进行比较分析。结果进一步证实IBV是导致此种野外发生的腺胃相关疾病的病原。 采用DNAstar软件中的Clustal Ⅴ法，将推定的分离毒株Q1、J2和T3的S1氨基酸序列与47个Genbank中的公开序列进行了比较。结果显示，3个分离毒株的S1蛋白间有16.5％的氨基酸差异，有17个特有的氨基酸替换和独特的裂解位点，表明它们具有独特的基因型。分离毒株T3与疫苗毒株H120的S1蛋白间的差 传染性支气管炎致腺胃病变毒株变异的分子基础及我国和东南亚分离株的分子流行病学研究 异为25．9％，该结果可能可以解释为什么这些毒株感染仍然能引起用H120免疫过 的鸡群发生严重的疾病。 由于SI蛋白序列99－12川立氨基酸之间的序列可能对病毒的致病性起重要作 用，SI蛋白5，高变区（56－69；117－131）与中和表位和血清型密切相关，这些 区域在IBV血清型和基因型间起联系作用。本文的3个分离毒株QI、JZ和T3在 SI高变区的 87（E），88（L），95（G）和 119（N）有 4个特有的替换，在 3’ 末端有独特的裂解位点R－XS－R－T－G丁，这些结果可能对这些分离毒株的血清型 特异序列和组织趋向性和致病性的分子决定区方面的研究有重要的价值。 为了追溯我国和东南亚传染性支气管炎病毒分离株的起源及进化位置，将24 个分离株和三个参考毒株的 SI基因 5’端含高变区 I和＊的区域以及含细胞毒 T 淋巴细胞表位的核衣壳基因3’端序列与GenBank中公开序列进行了比较。系统 发生树分析结果表明，2 4个分离毒株可以分成 3个明显的群，即美洲、亚洲和欧 洲群，一些分离毒株形成了一个十分明显的亚洲进化群，提示 IBV在亚洲的存在 已经有一定的时间。研究结果还显示，IBV在体内可以发生高频重组，这对IBV 分离毒株的分化起到促进作用。值得注意的是，在自然条件下，IBV 的重组可能 会发生在疫苗毒株与野毒株之间。