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华东地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查及其感染性核酸的构建

芦银华  
【摘要】: 1、在全面分析猪圆环病毒(PCV)两种血清型基因组差异的基础上,设计合成引物,建立了用于PCV1与PCV2检测分型的复合PCR方法。应用该方法对5株猪源细胞系及127份患呼吸道疾病的断奶仔猪病料进行了PCV检测。结果显示,5株细胞都可扩增出PCV1的基因片段,其中1株PK-15细胞还扩增得到了PCV2的DNA片段;上海、江苏、山东及浙江四个省市患呼吸道疾病的猪群中普遍存在PCV感染,其中PCV2感染最为普遍,感染率分别为27.3%(3/11)、15%(3/20)、23.1%(6/26)及48.1%(13/27);其次是PCV两种血清型的混合感染,四省市的感染率分别达18.1%(2/11)、20%(4/20)、7.7%(2/26)及19.2%(5/27),患呼吸道疾病的猪群中也存在一定比例的PCV1感染。 2、根据Genbank中发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪细小病毒(PPV)基因序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV的RT-PCR及PCR方法。应用建立的方法对38个PCV2阳性病科进行了PRRSV及PPV检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况。结果表明,15份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的39.4%;2份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占5.3%。另外,还存在一定比例的三重感染,共3个样品,占7.9%。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。 3、将5份经复合PCR检测为PCV2阳性的病料分别接种无PCV1污染的PK-15细胞,盲传4代,分别用PCR、间接免疫荧光试验(IFA)及超薄切片电镜观察鉴定PK-15上PCV2病毒增殖情况。结果表明,从5株PK-15细胞中均扩增出了1154bp的PCV2特异条带;IFA试验显示细胞核中含有大量的病毒抗原;在电镜下可见到典型的PCV2病毒颗粒,直径约为17~20nm。将分离的5株PCV2分别命名为JiangsuPCV、ShanghaiPCV、Zhejiang1PCV、Zhejiang2PCV及ShandongPCV,并测定了各毒株的TCID_(50)。以分离的PCV2病毒作为抗原建立了用于检测PCV抗体的IFA方法。应用该方法对临床送检的133份血清样品进行PCV抗体检测,结果显示,PCV抗体阳性率达58.9%。 4、根据Genbank中发表的PCV2毒株的全基因组序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增出5个PCV2分离毒株的全基因组。将扩增片段克隆于pcDNA3载体的EcoRI酶切位点,经氨苄青霉素(Amp)抗性筛选及EcoRI酶切鉴定,获得5个含有不同PCV2全基因组的阳性重组质粒,分别命名为pcDNAJSpcv、pcDNASHpcv、 芦银华:华东地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查及其感染性核酸的构建 peDNAZJlpev、peDNA刀Zpev及peDNAsDPcv。对质拉中的插入片段进行序列测定表 明,5个全基因组扩增片段均长1 768bP,与资料报道相符。应用DNAstar序列分析软 件,对测定的5个PCVZ分离株序列与Genbank中的国内外PCV毒株进行同源性比较 并绘制系统发生树,结果表明本实验的5个PCVZ毒株与世界上其它地区的PCVZ分 离株密切相关,核普酸序列同源性为94.5%一100%,与PCVI毒株的序列同源性只有 69.7%一71.1%。另外,不同PCvZ毒株之间基因组序列相对比较保守,但来源于不同地 区的PCVZ分离株基因组序列存在明显差异。系统发生进化树显示,本实验中的 shanghaipcv、zhejianglPCv、JiangsupCv三个毒株与一美国毒株AfZ尔旧39亲缘关系 较近,shandongPCv与劝句langZpCv与一德国分离株AF201311有较密切的亲缘关系。 5、通过两种方法构建了猪圆环病毒2型的感染性核酸。1)、将已构建的含单拷 贝PCVZ全基因组的重组质拉peDNA讲v用石七口RI酶切,获得PcvZ全基因绷1 768bP) 的双链形式,在体外用T4 DNA连接酶连接环化;2、用石七口RI对peDNApev质粒进行 不完全酶切,获得含有PCVZ全基因组单拷贝的线性载体,去磷酸化后与另一个PCVZ 全基因组拷贝连接,转化DH5a感受态细胞,通过氛千青霉素(AmP)杭性筛选及EcoRJ 酶切鉴定,获得含有双拷贝的重组质拉peDNAd伴v。对质拉中序列进行浏定,发现2 个拷贝的全基因组一前一后同一方向排列。用脂质体法将双链PCVZ全基因组体外环 化产物、重组质粒peDNA伴v及peDNAdPcv分别转染无PCv污染的PK一巧细胞,4 次连续传代后,用PcR、间接免疫荧光试验(开汽)及超薄切片电镜观察,发现转染体 外环化产物及peDNAdpcv的细胞中存在具复制能力的PCvZ病毒,而转染重组质拉 peDNA伴v的细胞未检测到病毒的产生。将转染后获得的病毒感染PK一巧细胞,用正叭 进行检测,可以见到细胞核内存在大量的病毒抗原。由此可见,本试验构建的环化的 双链PCvZ全基因组及含有双拷贝基因组的重组质粒peDNAd拌v具有感染性,从而为 进行PCVZ致病性及致病机理研究打下了基础。


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