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生长抑素基因工程活载体苗细胞生产工艺的建立及其检测技术

吴荣春  
【摘要】: 生长抑素基因重组痘苗病毒(VV/SS)作为活载体苗免疫动物,可促进动物生长。由于细胞培养的病毒滴度及表达产物量低,目前采用SPF鸡胚进行生产。本试验以DJRK细胞培养VV/SS,分析其增殖与表达情况。VV/SS病毒经过细胞适应性传代,可以在DJRK细胞上增殖并表达融合蛋白(HBsAg-SS)。为增加病毒的产量,采用转瓶培养细胞的方式,并且优化了血清等培养条件。将病毒产量及表达产物与鸡胚苗比较,两者的表达水平相当。从而为建立生长抑素基因工程活载体苗的细胞生产工艺奠定基础,该工艺更简易、适合规模生产。 VV/SS在细胞中增殖的同时,不断地分泌融合蛋白HBsAg/SS。因此,融合蛋白的表达量是衡量VV/SS增殖情况的一个重要指标。利用双抗体夹心ELISA法,检测VV/SS病毒细胞增殖时释放的融合蛋白载体部分(HBsAg);而采用双夹心ELISA法,检测与其融合表达的SS。结果表明所建立的方法能够满足检测的需要。 为评价融合蛋白HBsAg/SS的免疫原性,用间接ELISA法分别检测VV/SS细胞苗免疫动物后产生的SS抗体及HBsAb。首先利用渗透休克法提取的基因工程表达产物Trx/ss为包被抗原,检测血清中SS抗体。其次,HBsAg为包被抗原,检测HBsAb。经阻断试验和重复性试验,表明所建立的上述两种方法,特异性和重复性均好。为扩大免疫动物血清检测范围,用酶标SPA代替酶标二抗,但所测得的0D值要比酶标二抗体所得值小。 用蚀斑法滴定病毒是感染病毒颗粒定量的一种较准确的方法。探讨了影响VV/SS病毒蚀斑计数的部分因素,结果表明,营养液的残留量、不同的吸附条件、读数时间等对病毒蚀斑的形成影响比较显著。90h前,接毒细胞用琼脂糖覆盖与否对蚀斑的测定结果无明显差异。 DJRK细胞是传代细胞系,对其致肿瘤性进行了检测。选择处于对数生长期的DJRK细胞进行消化、离心、计数后,制备细胞悬液,接种裸鼠,定期观察,观察病理组织形态学变化。判定结节是否具有肿瘤的特性。DJRK细胞接种裸鼠后全都有肿块形成,经病理形态学检查,均为肿瘤组织,其致瘤率为100%。但是其肿瘤形成的速度较慢,在前21天只形成米粒大小的瘤体,40天时则形成体表明显可见的瘤组织。荷瘤的裸鼠脾脏异常肿大。


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