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小尾寒羊朊蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定

张海涛  
【摘要】: 传染性海绵状脑病(TSE)是一种重要的人畜共患病,羊TSE称为痒病。痒病是由于PrP~c转变成PrP~(Sc)所致。痒病免疫组化检测为目前最有效的检测方法,组织切片经蛋白酶K消化以后,PrP~c被全部消化,而PrP~(Sc)的核心片段则保留下来。由于PrP~c与PrP~(Sc)具有相同的蛋白序列,制备PrP~c核心片段的单克隆抗体,可用于痒病的免疫组化检测。因此,为研究痒病的检测方法,本实验将利用聚合酶链式反应(PCR)克隆我国绵羊朊蛋白基因,在大肠杆菌中进行原核表达。 小尾寒羊外周血中分离淋巴细胞,提取基因组DNA。用PCR方法从绵羊基因组DNA中获得编码小尾寒羊朊蛋白核心蛋白片段的DNA,在其基因的5′端和3′端引入EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点,下游引物将原序列TATTAC突变为TAATAA产生两个终止密码子。限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pET-32a(+)和PCR产物,然后分别用试剂盒SpinPrep Gel DNA Kit分别纯化。按载体与插入片段比为1:3比例混合,T4DNA连接酶连接,构建成功重组表达质粒PrP-pET-32a(+)。TSS法转化E.coliDH5 a,PCR筛选鉴定阳性克隆。序列分析表明所克隆片段大小、基因插入方向和位置符合表达要求。 PrP-pET-32a(+)转化E.coli BL21,首先研究了重组表达质粒PrP-pET-32a(+)在不同温度和不同培养基中的稳定性。结果表明,37℃诱导条件下,约60%E.coli BL21丢失质粒,SDS-PAGE电泳未能检测出融合蛋白Trx-PrP~c27-30的表达。25℃培养诱导条件下,90%E.coli BL21带有重组质粒PrP-pET-32a(+),SDS-PAGE电泳检测出融合蛋白Trx-PrP~c27-30呈高表达。分别研究不同诱导温度、不同AMP浓度、不同时间、不同IPTG浓度和不同乳糖浓度对融合蛋白表达的影响。结果表明,随时间的增加蛋白表达逐渐增加,4h融合蛋白表达量最高可占细菌总蛋白的46.9%。IPTG浓度对Trx-PrP~c27-30表达的影响不大,0.1mM-5mM之间融合蛋白表达量相似。乳糖可使E.coli BL2的生长速度加快, 小尾寒羊阮蛋白核心片段的基因克隆、原核表达、纯化与鉴定 浓度大于5%时融合蛋白表达量下降.丑co1,’ BLZ表达菌超声波裂解后电泳,结 果表明,蛋白几乎全部存在于包涵体中,超声波裂解上清和细胞周质中无融合蛋 白存在.Western一Blot鉴定证明该表达融合蛋白符合预期结果,为小尾寒羊PrPc 核心蛋白. 本实验构建了小尾寒羊PrPc核心蛋白重组表达质粒PrP一pET一32a(+), 表达出3 SKD融合蛋白,经鉴定符合预期结果.从而,为检测痒病用单克隆杭体 的研制莫定了基础.


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