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河蟹“颤抖病”病毒特性分析

金业  
【摘要】: 从感染“颤抖病”的河蟹(中华绒螯蟹)中分离纯化出一种病毒,接种健康河蟹,表现出典型的“颤抖病”症状,证实此病毒为病原。电镜观察显示,病毒粒子呈球状,有囊膜和纤突,直径约为150nm,病毒核酸呈单股线状。在0.8%琼脂糖凝胶电泳中,病毒核酸呈单一条带,大小为15~16kb,纯化的病毒核酸对Dnase Ⅰ不敏感,对Rnase、Mung Bean Nuclease敏感,推测该核酸为ssRNA。根据以上特性判断,引致河蟹“颤抖病”的病毒为副粘病毒样病毒(Paramyxovirus-like virus)。 对河蟹(中华绒螯蟹)“颤抖病”病毒及其核酸进行了电镜观察。纯化病毒经负染后由电镜观察显示,病毒粒子呈球状,有囊膜和纤突,直径约为150nm。纯化病毒经核酸酶降解杂核酸后,加入8mol/L尿素释放病毒核酸,经水相法展开后,用覆有碳膜的铜网取样,再经染色和真空镀膜,于电镜下观察,病毒核酸呈单股线状。底片经光学精确放大后,测定了核酸分子的长度,根据经验公式计算出病毒核酸分子量为5.055×10~6。抽提的病毒核酸在0.8%琼脂糖凝胶电泳中呈单一条带,大小为15~16kb,经核酸酶酶切显示,核酸对Dnase Ⅰ不敏感,对Rnase、Mung Bean Nuclease敏感,根据以上特性判断,该核酸为ssRNA。 采用ELISA双抗体夹心法检测患“颤抖病”的河蟹病料,致病性病毒的阳性检出率为92.5%(37/40)。用10个具有丰富多态性的10碱基随机引物,对患有“颤抖病”的河蟹和健康河蟹群体进行RAPD分析。筛选出一个引物,将其扩增产物克隆至pUCm-T载体中,对其序列分析表明,该产物与恶臭假单胞菌具有85%的同源性,根据该序列设计一对特异性引物(P1/P2),对病蟹和健康河蟹进行检测,其阳性检出率为33%(8/24)。采用细菌16S rDNA基因保守区特异性引物,检测患有“颤抖病”的河蟹和健康河蟹群体,其阳性检出率为33%(8/24)。根据上述结果推测,部分患有“颤抖病”的河蟹存在假单胞菌的继发感染。


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