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两种遗传工程小鼠的检测、鉴定与种质保存方法的研究

曲玉秀  
【摘要】: 本文针对上海转基因研究中心现存的Neo~r转基因小鼠与人源化IgM抗体五特征小鼠各自的特点分别进行了相应的检测、鉴定保种研究;并进行了普通小鼠不同阶段胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究。 一、纯合子Neo~r转基因小鼠的品系建立及鉴定 通过胚胎移植的生物净化方法获得10只清洁级F_1小鼠,经检测其中5只为整合阳性。采用全同胞交配方式对转基因小鼠进行繁育,经PCR、Southern blot杂交和交配实验检测相结合的方法,选育出4只纯合子,并建系。验证了由该杂合转基因小鼠胎儿制备的成纤维细胞具有G418抗性,可作为ES细胞培养中的饲养层细胞。由上述研究说明,通过遗传学和微生物学上对Neo~r转基因小鼠的质量控制,使Neo~r转基因小鼠达到了清洁级,并以纯合子状态保存。 二、人源化IgM抗体五特征小鼠的生物学特征研究 对由英国Babraham实验室引进的人源化IgM五特征小鼠分别从繁育学和免疫学方面进行了生物学特性的研究。结果表明,繁殖性能:五特征小鼠的初怀周龄为6-8周;窝产仔数、离乳数,雄性比例在不同窝间的差异显著,平均分别为5.6只、5.0只、56.0%;繁育母鼠的产仔数、离乳数在头4胎均随胎次增加而提高,4胎以后繁育能力下降;平均胎间距在不同胎次间的差异并不显著,平均为29.1天。生长发育状况:通过对29只雌鼠,34只雄鼠自出生起至9周龄,每周在同一时间进行体重称量,得出同一周龄的五特征小鼠在3周龄断奶后雄鼠生长的比雌鼠快,且差异极显著。免疫学方面的研究:对五特征小鼠血清中的IgM进行了定性和定量检测,结果表明,血清中含有人源IgM且人源IgM含量高于鼠源IgM;通过对同窝的4只雄鼠的6-11周龄血清中人源IgM含量进行测定,得出同一周龄的不同个体间的血清中人源IgM含量存在显著差异,并随鼠龄的增加而提高;经血管内皮生长因子(VEGF)抗原免疫后,五特征小鼠血清中的人源IgM含量增加,且随免疫次数增加,含量提高。 三、小鼠不同阶段胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究 采用玻璃化冷冻法对ICR、C57BL/6、DBA*C57BL/6杂交F1代三种品系小鼠的不同阶段胚胎进行冷冻保存,比较胚胎解冻后形态良好率、体外发育率和移植后的出生率,结果表明解冻后各品系小鼠胚胎从2细胞到桑椹胚形态良好率在75%以上,其中8细胞胚胎形态良好率在83%以上,而囊胚的形态良好率仅在40%左右。解冻后胚胎体外培养的发育率随胚胎发育阶段的提高而提高,桑椹胚的发育达93%以上。体外受精2细胞冷冻胚与体内受精2细胞冷冻胚比较,二者形态良好率差异无显著意义(74%: 两种遗传工程小鼠的检测、鉴定与种质保存方法的研究 75%),但体内受精冷冻胚的发育率显著高子体外受精冷冻胚门纷:40儿 p功.01); 胚胎经过三次反复冻融后形态良好率无显著差异;冷冻2细胞胚移植后的受孕率与仔 鼠出生率分别达64%和40%,但均低于新鲜2细胞胚胎。


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