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棉蚜的杀虫剂神经靶标分子生物学研究

李飞  
【摘要】: 由于神经系统在维持生命中的特殊功能,人类以神经系统为作用靶标,开发了大量的速效性杀虫剂。当前广泛应用的有机磷类、氨基甲酸酯类、沙蚕毒素、新型烟碱类和拟除虫菊酯类杀虫剂,均以昆虫神经系统内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱受体(AChR)和钠离子通道为作用靶标。因此,开展杀虫剂神经靶标的分子生物学研究,深入了解杀虫剂毒理,明确抗药性形成的分子机制,对开展抗性的分子检测、抗性治理以及开发新型高选择性杀虫剂都具有十分重要的意义。 棉蚜(Aphis gossypii Glover)是世界性分布的重大农业害虫,由于其生殖周期短、繁殖量大,一旦条件适宜,在短期内便能爆发危害。因此,对于棉蚜的防治,其它农业防治技术和生物防治技术较难奏效,生产上主要依赖于化学防治。这种对农药的依赖性,不仅使棉蚜成为抗药性发生最严重的农业害虫之一,同时,其抗药性的发展也直接威胁到能否进行可持续控制的问题。为了更深入地了解棉蚜抗药性形成的分子机制,更好地开展棉蚜抗性的检测和治理,弄清棉蚜神经靶标的分子结构以及与非靶标生物的进化差异,为开发新型高选择性杀虫剂和负交互抗性杀虫剂,保证棉蚜的可持续控制,本文对其神经系统靶标进行了较为系统的研究。 1 棉蚜标准试虫饲养方法及不同寄主对棉蚜影响的研究 本研究首先根据棉蚜的生活习性摸索出一种新的棉蚜饲养新方法——笼罩法,并就不同寄主对棉蚜的影响进行了研究。结果发现,棉花、木槿和南瓜等寄主作物对棉蚜AChE和羧酸酯酶均有不同程度的影响,其中取食棉花的棉蚜AChE对乙酰胆碱亲和能力最大,取食木槿的羧酸酯酶活力最高。对有机磷类农药的敏感性也随之发生了变化,其中以取食木槿上的棉蚜敏感性下降最为显著。在此基础上,本研究建立了棉蚜的笼罩棉苗饲养法。该方法省时省力,不仅能减少试虫饲养的工作量,还能保证试虫的质量和可比性,能够满足室内不间断地隔离饲养多个棉蚜品系的要求,为进行长期研究并获得可靠资料奠定了基础。 2 棉蚜品系的建立及有机磷抗性与AChE不敏感性关系的确定 引进英国洛桑试验站171B棉蚜品系为敏感品系,采集中国北京、安阳、莱阳、南京和泰安等不同地区的棉蚜,分离5个抗性水平不同的抗性品系。利用浸叶法生物测定结果表明,不同地区品系对杀虫剂的抗性依次为:安阳>北京>南京、莱阳>泰安。进一步的生化研究表明,安阳和北京品系棉蚜AchE对杀虫剂的敏感性显著下降(I_(50) 棉蚜的杀虫剂神经靶标分子生物学研究 增加50多倍),莱阳品系次之,南京和泰安品系接近于敏感品系.安阳和北京品系AChE 的蛛值显著下降,表明酶发生了质的变化。不同地区杭性品系的醋酶(全醋酶和菠 酸醋酶)活性均显著升高.其中安阳品系拨酸醋酶几值达2460.4 p mol·L一,,而北京 品系仅为84.4 p Iuol·L一,,显示该2品系欺酸醋酶发生了质的变化。分析认为,低杭 水平的泰安品系以代谢杭性为主,靶标杭性为辅;中杭水平的南京和莱阳品系,,.是由 于解毒代谢酶的活性增强,抑或由于靶标的敏感性下降所致;而高杭水平的安押和北 京品系,是由代谢杭性和靶标杭性共同作用导致的. 3 AchE的分子生物学研究 3.1蛋白纯化 利用普普卡因胺亲和层析法建立了棉蚜AChE分离纯化技术,分离纯化了棉蚜敏感 品系和杭性品系的AChE,其纯化倍数分别为35,100和33,680倍,回收率分别为30.3% 和”.8呱.纯化后AChE在非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳(P AGB)中呈现3条带型,在 变性聚丙烯疏胺凝胶电泳(SDS一P人GE)中为1条带,表明纯化后AChE已达电泳级 纯度.以甲胺磷和杭蚜威分别对粗酶和纯化酶作抑制性试验,敏感品系粗酶的几。甲 胺磷为0.6491 Iuluol·L一,、杭蚜威为1.203 Inlnol·L一,;纯化酶Is。甲胺磷为0.5471 Inmol·L一,、杭蚜威为0.8613 nuuol·L一‘;粗酶/纯酶的差异分别为1.19和1.40倍。抗 性品系粗酶的几。甲胺磷为2似.叫mmol .L--l、抗蚜威为28.26mm。1·L一,;纯忆酶Is0 甲胺磷为34.22 mlnol·L一,、抗蚜威为2.41 nunol·L一‘;粗酶/纯酶的差异分别达到6.43 和n.73倍.结果表明,纯化后棉蚜AChE的敏感性显著升高,其中杭性品系棉蚜 AChE的敏感性上升幅度明显高于敏感品系。作者分析认为,粗酶体系中非AChE成 分的存在对人。有显著影响,而杭性品系的这种影响更为显著. 3.2 AChE基因克隆 采用RT一PCR技术和RACE策略,从棉蚜中克隆出2个ace基因。a oel基因全长为 2,371 bp,开放阅读框为2,031 bp,编码676个氨基酸(GeneBank登录号:AF502082); aeeZ基因全长序歹,l为2,1 30 bp,开放阅读框为1,995 bp,编码664个氨基翻CeneBank 登录号:AF502081)。acel和aceZ基因所编码的氨基酸序列之间的相似性仅达48%, 但acel基因与已克隆的麦二叉蚜ace基因(AF321574)之间的相似性达95先 .aceZ 基因与已报道的桃蚜ace(AF287”1)之间的相似性达92%.序列分析表明,滋el和 aceZ基因具有AChE家族所有的保守性特征。此外,还发现了棉蚜ace基因5’端的 选择性剪接现象. 尽管在AChE毒理学研究中,研究者一直怀疑昆虫中有不同的AChE存在,但始 终没


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