盐胁迫下库拉索芦荟cDNA消减文库的构建筛选及NADP-苹果酸酶基因的盐诱导表达

【摘要】： 干旱、高盐、寒冷和高温等非生物胁迫严重影响着植物的生长发育。其中，水分胁迫是造成全世界作物产量降低的最重要的环境因素。为此，人们从遗传和细胞水平上对水胁迫下植物体内的变化做了大量而广泛地研究工作，而且，利用分子和遗传的手段克隆和鉴定了许多盐胁迫诱导基因。但是，这些基因在高等植物中耐盐或盐敏感的生理作用还很不清楚，而且还有很多耐盐相关基因没有被发现或明确。因此，本研究从植物基因整体水平上去探讨耐盐相关基因，对揭示植物耐盐的分子机理是十分必要的。 目前，几种分子生物学技术已用于克隆鉴定多种环境胁迫下的差异表达基因。这些技术包括：mRNA差别显示法(DDRT-PCR)、抑制消减杂交法(SSH)、基因表达系列分析(SAGE)、基因芯片和cDNA微阵列(DNA-chip and microarray)和cDNA-AFLP标记等。在这些技术当中，抑制消减杂交(SSH)具有快速、高效、假阳性率低等特点。我们利用抑制消减杂交技术成功地构建了高盐胁迫下库拉索芦荟的消减文库。筛选文库后，对获得的基因进行了较细致的鉴定分析。 主要研究方法： 消减文库的构建和筛选：为了从基因整体水平上破解芦荟耐盐的分子机理，本研究选用较耐盐品种-库拉索芦荟幼苗为材料，利用抑制消减杂交技术首先建成了盐胁迫下芦荟的消减文库。 分别提取纯化盐处理和对照芦荟叶片组织Poly (A)~+RNA，再依次合成单链和双链cDNA。将实验方的双链cDNA分成两组，分别与两种不同的接头连接(adaptor 1 and adaptor 2R)。接着与驱逐方cDNA杂交两次及两轮抑制PCR。以经过驱逐方cDNA消减的第二次PCR产物与T／A质粒载体连接，建成cDNA消减文库。 随后利用差示筛选技术对构建的消减文库进行了初步筛选。随机挑取64个克隆进行点杂交，鉴定出盐胁迫下差异表达的侯选cDNA克隆。再随机挑取其中的3个单向测序，并与GenBank数据库中序列进行同源比较。 盐胁迫下库拉索芦荟叶子中NADP-苹果酸酶基因的表达鉴定：为了检测芦荟 盐胁迫下库拉索芦荟cDNA消减又库的构建筛选及NADP一苹果酸酶基因的盐诱导表达 中NADp一苹果酸酶基因‘刀叻心)的表达和NADP一苹果酸酶(NADp一ma 1 ie enzyme) 蛋白的积累是否受着高盐的诱导，我们利用耐盐品种库拉索芦荟(A了口。。。 乙，)和盐敏感品种皂质芦荟(A了。。胭P助打邵施叫为材料，进行了Nor thern Blotting和酶活测定。 同样用Northern Blotting对几种胁迫条件下，库拉索芦荟NADP一苹果酸酶 基因A叻贸的表达情况进行了分析。 Western Blot分析了NADP一苹果酸酶蛋白合成随盐胁迫的变化情况。 主要结果: 1.建成了盐胁迫下库拉索芦荟消减文库。看家基因去沪7a鉴定表明，文库具有 较高的消减效率。随机挑出13个克隆进行限制内切酶分析，结果有10个质粒 含有300一600bp的插入片段。经差示筛选，我们鉴定出10个在盐处理库拉索芦 荟中特异表达的候选克隆。对其中的3个进行单向测序。其中一个序列在GenBank 中登录，获得的序列号为No.AY179511. 2.盐处理12个小时后NADP一苹果酸酶mRNA诱导增加，且两种芦荟中的表达量 都在48，J、时后达到高峰。但是其表达水平是不相同的，A了。。二厂:L.显然比 Aj肥sap卯盯”旅二高出许多。如此相类似，NADP一苹果酸酶活性在盐处理12 小时后开始诱导增加，活性稳步增加至72小时。但是A1口。。厂:L.中NADP一苹 果酸酶活性较Al口。胭p二:厂。施二中NADP一苹果酸酶活性高的多。这些表明， 盐胁迫可以诱导这两种芦荟中的NADP一苹果酸酶基因的表达和 NADP一苹果酸酶蛋 白的积累，但是诱导的强度与芦荟品种的耐盐程度有关。 3.NADP一苹果酸酶基因A卜叨想的表达受盐、干旱和外源ABA的诱导表达，但寒冷 处理似乎对其不起作用。其中，Al楠听mRNA的盐诱导强度最高。盐处理后12个 小时，A不喃心mRNA有明显的诱导表达，一直增加到72小时，接着有所下降;干 旱处理6个小时后A不诵留mRNA也被诱导，一直增加到12小时后下降;外源ABA 处理后，A下喃留mR琳的积累较盐、干旱胁迫早。3个小时后，Al诵伍mRNA就快速 积累，持续到12小时. 4.We“tern Blot分析表明盐处理48小时后NADP一苹果酸酶合成明显增强，且 其强度随着处理时间的延长而提高。这一结果与前面的泊确留转录水平的变化相 一致。