收藏本站
收藏 | 论文排版

盐胁迫下库拉索芦荟cDNA消减文库的构建筛选及NADP-苹果酸酶基因的盐诱导表达

孙淑斌  
【摘要】: 干旱、高盐、寒冷和高温等非生物胁迫严重影响着植物的生长发育。其中,水分胁迫是造成全世界作物产量降低的最重要的环境因素。为此,人们从遗传和细胞水平上对水胁迫下植物体内的变化做了大量而广泛地研究工作,而且,利用分子和遗传的手段克隆和鉴定了许多盐胁迫诱导基因。但是,这些基因在高等植物中耐盐或盐敏感的生理作用还很不清楚,而且还有很多耐盐相关基因没有被发现或明确。因此,本研究从植物基因整体水平上去探讨耐盐相关基因,对揭示植物耐盐的分子机理是十分必要的。 目前,几种分子生物学技术已用于克隆鉴定多种环境胁迫下的差异表达基因。这些技术包括:mRNA差别显示法(DDRT-PCR)、抑制消减杂交法(SSH)、基因表达系列分析(SAGE)、基因芯片和cDNA微阵列(DNA-chip and microarray)和cDNA-AFLP标记等。在这些技术当中,抑制消减杂交(SSH)具有快速、高效、假阳性率低等特点。我们利用抑制消减杂交技术成功地构建了高盐胁迫下库拉索芦荟的消减文库。筛选文库后,对获得的基因进行了较细致的鉴定分析。 主要研究方法: 消减文库的构建和筛选:为了从基因整体水平上破解芦荟耐盐的分子机理,本研究选用较耐盐品种-库拉索芦荟幼苗为材料,利用抑制消减杂交技术首先建成了盐胁迫下芦荟的消减文库。 分别提取纯化盐处理和对照芦荟叶片组织Poly (A)~+RNA,再依次合成单链和双链cDNA。将实验方的双链cDNA分成两组,分别与两种不同的接头连接(adaptor 1 and adaptor 2R)。接着与驱逐方cDNA杂交两次及两轮抑制PCR。以经过驱逐方cDNA消减的第二次PCR产物与T/A质粒载体连接,建成cDNA消减文库。 随后利用差示筛选技术对构建的消减文库进行了初步筛选。随机挑取64个克隆进行点杂交,鉴定出盐胁迫下差异表达的侯选cDNA克隆。再随机挑取其中的3个单向测序,并与GenBank数据库中序列进行同源比较。 盐胁迫下库拉索芦荟叶子中NADP-苹果酸酶基因的表达鉴定:为了检测芦荟 盐胁迫下库拉索芦荟cDNA消减又库的构建筛选及NADP一苹果酸酶基因的盐诱导表达 中NADp一苹果酸酶基因‘刀叻心)的表达和NADP一苹果酸酶(NADp一ma 1 ie enzyme) 蛋白的积累是否受着高盐的诱导,我们利用耐盐品种库拉索芦荟(A了口。。。 乙,)和盐敏感品种皂质芦荟(A了。。胭P助打邵施叫为材料,进行了Nor thern Blotting和酶活测定。 同样用Northern Blotting对几种胁迫条件下,库拉索芦荟NADP一苹果酸酶 基因A叻贸的表达情况进行了分析。 Western Blot分析了NADP一苹果酸酶蛋白合成随盐胁迫的变化情况。 主要结果: 1.建成了盐胁迫下库拉索芦荟消减文库。看家基因去沪7a鉴定表明,文库具有 较高的消减效率。随机挑出13个克隆进行限制内切酶分析,结果有10个质粒 含有300一600bp的插入片段。经差示筛选,我们鉴定出10个在盐处理库拉索芦 荟中特异表达的候选克隆。对其中的3个进行单向测序。其中一个序列在GenBank 中登录,获得的序列号为No.AY179511. 2.盐处理12个小时后NADP一苹果酸酶mRNA诱导增加,且两种芦荟中的表达量 都在48,J、时后达到高峰。但是其表达水平是不相同的,A了。。二厂:L.显然比 Aj肥sap卯盯”旅二高出许多。如此相类似,NADP一苹果酸酶活性在盐处理12 小时后开始诱导增加,活性稳步增加至72小时。但是A1口。。厂:L.中NADP一苹 果酸酶活性较Al口。胭p二:厂。施二中NADP一苹果酸酶活性高的多。这些表明, 盐胁迫可以诱导这两种芦荟中的NADP一苹果酸酶基因的表达和 NADP一苹果酸酶蛋 白的积累,但是诱导的强度与芦荟品种的耐盐程度有关。 3.NADP一苹果酸酶基因A卜叨想的表达受盐、干旱和外源ABA的诱导表达,但寒冷 处理似乎对其不起作用。其中,Al楠听mRNA的盐诱导强度最高。盐处理后12个 小时,A不喃心mRNA有明显的诱导表达,一直增加到72小时,接着有所下降;干 旱处理6个小时后A不诵留mRNA也被诱导,一直增加到12小时后下降;外源ABA 处理后,A下喃留mR琳的积累较盐、干旱胁迫早。3个小时后,Al诵伍mRNA就快速 积累,持续到12小时. 4.We“tern Blot分析表明盐处理48小时后NADP一苹果酸酶合成明显增强,且 其强度随着处理时间的延长而提高。这一结果与前面的泊确留转录水平的变化相 一致。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李斌,陈冬兰,施教耐;高粱NADP苹果酸脱氢酶的纯化及其分子特性[J];植物生理与分子生物学学报;1987年02期
2 范义积,姜义华,钱月琴;辅酶Ⅱ的无机光还原[J];中国科学A辑;1976年05期
3 杨万年,何之常;孔雀绿定磷法测定植物NADP磷酸酶活性[J];植物生理学通讯;1998年04期
4 王方元;异柠檬酸脱氢酶(IDH)在小鼠胚胎发育中的变化[J];动物学杂志;1990年03期
5 范义积,钱月琴,姜义华;在可见光下,辅酶Ⅱ的无机光还原和腺三磷的无机光合成[J];中国科学A辑;1978年05期
6 曹日强,周志明;地钱、肾蕨和中山柏中的NADP硫氧还蛋白系统[J];植物生理与分子生物学学报;1989年02期
7 迟伟,阳江华,张青婵,吴乃虎;水稻的4个NADP-ME基因具有不同的表达模式[J];自然科学进展;2004年12期
8 李永海,徐燕,席慧,刘凤华,周霞,高音;大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化[J];首都师范大学学报(自然科学版);2005年01期
9 汪新颖;王波;侯松涛;朱国萍;;苹果酸脱氢酶的结构及功能[J];生物学杂志;2009年04期
10 王二力,许廷森;蚕氨基酸代谢的研究:蚕体内由苹果酸形成丙氨酸碳架的机制[J];昆虫学报;1982年01期
11 杨万年,何之常;钙调素依赖性NAD激酶及其在植物体内的功能[J];武汉植物学研究;1999年S1期
12 范义积,叶岳兴;无机发光材料与植物的光催化反应[J];发光学报;1979年Z1期
13 孙淑斌,沈其荣,万建民,刘兆普;盐胁迫对库拉索芦荟叶片中NADP- 苹果酸酶基因的诱导表达(英文)[J];生物化学与生物物理学报;2003年05期
14 周长海,田中桂一;肉鸭肝脏脂肪酸合成酶活性及脂肪酸合成途径的研究[J];东北师大学报(自然科学版);2004年03期
15 王鹏;赵旵军;翟羽佳;朱国萍;;植物NADP~+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的分子进化及功能研究进展[J];生物学杂志;2009年03期
16 李永海,徐燕,席慧,刘凤华,周霞,高音;鸡溶菌酶和重组大肠杆菌融合蛋白(NADP-GDH)体外分子交联的初步研究[J];首都师范大学学报(自然科学版);2004年S1期
17 蔡望伟,凌光鑫,陈历昌;辅酶Ⅱ-亲和胶的制备和应用[J];生物化学与生物物理进展;1991年05期
18 范义积,钱月琴;含铁氧化还原素的无机光还原[J];科学通报;1978年03期
19 杨万年,何之常,张景昱,于华忠;光敏胞质雄性不育小麦育性转换期叶片中NAD激酶和NADP磷酸酶的变化[J];植物生理学报;1998年04期
20 ;变废为宝的新技术[J];中国科技信息;2000年17期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李丽;蒋园园;孙翀;杨小弟;;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP~+)与纳米AlOOH的作用[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年
2 苏军凯;文磊;郑有顺;;一氧化氮与吗啡依赖[A];首届中国中医药实验动物科技交流会论文汇编[C];2002年
3 张怀渊;赵建新;陈永泉;张灏;陈卫;宋元达;;耶氏解脂酵母油脂积累分子机制的初步探索[A];中国食品科学技术学会第八届年会暨第六届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2011年
4 牛书丽;蒋高明;李永庚;刘美珍;崔红霞;丁莉;彭羽;;固沙先锋植物木岩黄芪的光合适应性研究[A];“全国第五届青年植物生态学学术研讨会”暨“第二届植物生理生态学学术研讨会”论文摘要集[C];2004年
5 王丰;;水稻转基因遗传改良研究进展[A];中国青年农业科学学术年报[C];2002年
6 朱学艺;崔素霞;王锁民;;C_3植物芦苇响应生境变化的C_4光合特征[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年
7 雷新有;王彦军;;半导体光催化模拟光合磷酸化研究进展[A];2004年全国太阳能光化学与光催化学术会议论文集[C];2004年
8 董玲玲;吴锦华;韦朝海;李平;吴超飞;;厌氧条件下Fe~0-菌体-H_2O体系对硝基苯的降解[A];第二届全国环境化学学术报告会论文集[C];2004年
9 王鹏;叶济宇;A.Takabayashi;T.Endo;T.Shikanai;米华玲;;热胁迫下叶绿体Ndh复合体参与延缓烟草萎蔫的机理研究[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年
10 彭长连;阳成伟;林桂珠;陈贻竹;欧志英;;超高产杂交稻剑叶中C_4途径酶活性和稳定碳同位素分异作用的变化[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前8条
1 王秋林;机体氧化还原状态的研究[D];四川大学;2005年
2 顾采琴;Ca~(2+)、CaM及其目标酶与乙烯诱导番茄和草莓果实成熟衰老关系的研究[D];浙江大学;2003年
3 沙守峰;梨有机酸组分及含量变化与遗传鉴定[D];南京农业大学;2012年
4 孙淑斌;盐胁迫下库拉索芦荟cDNA消减文库的构建筛选及NADP-苹果酸酶基因的盐诱导表达[D];南京农业大学;2003年
5 李艳;酵母半乳糖代谢基因多重转录调控机制的研究[D];山东大学;2010年
6 谢国生;水稻在碳酸(氢)钠胁迫下基因表达与相关基因的克隆[D];华中农业大学;2002年
7 伍涛;丰水、鸭梨果实发育过程中糖积累特性及其与果实大小关系研究[D];南京农业大学;2011年
8 樊慧杰;大鼠急性心肌缺血心脏和背根神经节差异蛋白质组学和mRNA研究[D];山西医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘畅;水稻NADP-ME同工酶在逆境环境下的功能差异分析[D];东北林业大学;2011年
2 刘增辉;小麦NADP-苹果酸酶与逆境关系的初步研究[D];青岛科技大学;2010年
3 杨茹;毛果杨NADP-ME基因家族鉴定及其特性的研究[D];东北林业大学;2011年
4 李秀峰;水稻(Oryza sativa L.)苹果酸酶(NADP-ME3)基因的表达特性研究[D];东北林业大学;2012年
5 靳明明;铜绿微囊藻NADP~+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的鉴定及单体异柠檬酸脱氢酶的分子进化机制研究[D];安徽师范大学;2013年
6 徐振杰;高产油脂红酵母的选育及其NADP依赖型苹果酸酶基因保守片段的克隆[D];四川农业大学;2011年
7 李永海;重组大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶体外分子交联的初步研究[D];首都师范大学;2005年
8 吕小园;分子信标技术用于ATP等重要生物分子的检测[D];湖南大学;2007年
9 宋平;大肠杆菌苹果酸脱氢酶辅酶特异性改造及功能研究[D];安徽师范大学;2012年
10 周永双;还原力产生酶对大肠杆菌脂肪酸合成的影响[D];江南大学;2013年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 马尔丹;维他命B3 美白肌肤的新发现[N];北京日报;2002年
2 孙书静;螺旋藻的养殖与开发[N];中国特产报;2003年
3 王兴;天津工业生物技术研究所天然木糖酵母研究获进展[N];中国食品质量报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978