兔骨骼肌肌球蛋白热诱导凝胶特性及成胶机制研究

【摘要】：本论文由四个方面的研究内容组成：(1)兔骨骼肌肌球蛋白的提取、纯化和鉴定，及其溶液浊度和溶解度的研究；(2)肌球蛋白热诱导凝胶的硬度、保水性和超微结构研究；(3)肌球蛋白的流变学特性研究；(4)肌球蛋白热凝胶的形成机制研究，并初步提出了成胶机制假设。 第1章 兔骨骼肌肌球蛋白提纯、鉴定及理化性质：从体重2～2.5kg的3月龄新西兰公兔的兔腰大肌(Pasoas major,PM)和半膜肌(Semimembranosus proprius，SMp)中提取、纯化、鉴定肌球蛋白。肌球蛋白提取率为1％。纯化后的蛋白浓度为20～30mg·mL~(-1)。所得蛋白在SDS-PAGE图谱上出现四条带：肌球蛋白重链(Mw约205kDa)、三条轻链(MW约25.9kDa、17.8kDa、13.8kDa)。肌动蛋白的分子量为40kDa左右。 以肌球蛋白溶液在340nm的吸光度作为浊度的评价指标和离心后蛋白质浓度的变化作溶解度指标，并测定蛋白质浓度、加热温度、pH值、离子强度(Ionic strength，IS)、磷酸盐、二价金属离子和肌动蛋白因素对PM和SMp肌球蛋白溶液浊度和溶解度的影响。结果表明，肌球蛋白浓度与浊度呈正线性相关(R~2=0.97)；PM和SMp肌球蛋白在离子强度为0.6mol·L~(-1)的KCl溶液中pH值为5.5时浊度最大，溶解度在pH值大于5.0时显著上升；离子强度下降，肌球蛋白溶液的浊度会上升，而溶解度下降；温度升高肌球蛋白溶液浊度上升，PM肌球蛋白在55℃(IS 0.6)、60℃(IS 0.2)，SMp肌球蛋白在60℃(IS0.6)、55℃(IS0.2)其浊度达到最大值，温度升高溶解度下降；MgCl_2使肌球蛋白溶液浊度升高，溶解度下降；CaCl_2使肌球蛋白溶液浊度和溶解度均升高；在0.6 mol·L~(-1)KCl时，SPP、TPP使肌球蛋白溶液浊度下降，溶解度上升，而HMP则相反；在0.2mol·L~(-1) KCl时，SPP、TPP和HMP对肌球蛋白溶液浊度、溶解度影响复杂；肌动蛋白的添加使得蛋白溶液浊度上升，溶解度下降。 第2章 兔骨骼肌肌球蛋白热诱导凝胶的硬度、保水性和超微结构：研究了蛋白质浓度、pH值、离子强度、加热处理、磷酸盐、二价金属离子、非肉蛋白、亲水胶体(多糖)、转谷氨酰胺酶(TGase)、肌动蛋白等因素对肌球蛋白热诱导凝胶硬度、保水性和超微结构的影响。结果显示：凝胶硬度和保水性随蛋白浓度增加而逐渐增大；PM和SMp肌球蛋白凝胶(IS 0.6)在pH6.0和5.5时有最大硬度，pH6.0时保水性最大；硬度随离子强度增大而降低，达最大硬度时离子强度均为0.2，而最佳保水性条件均为0.2和1.0(两者间无差异)；PM凝胶硬度程序升温加热10min时大于恒温加热，最大硬度时加热温度均为70℃，但程序升温加热凝胶保水性均优于恒温加热处理，且在50℃时有最大值；SPP和TPP使凝胶硬度下降，HMP则相反；SPP和TPP可降低PM和提高SMp凝胶的保水性，而HMP可增大两者保水性；10和12mmol·L~(-1)的Mg~(2+)，8和10mmol·L~(-1)的Ca~(2+)能显著增加凝胶硬度；Mg~(2+)和Ca~(2+)减弱了凝胶的保水性；卡拉胶(Carr)对凝胶硬度和保水性均无影响；0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、1.0％的海藻酸钠(SA)及黄原胶(XG)显著提高PM肌球蛋白凝胶硬度，仅SA降低了SMp凝胶硬度；XG及0.5％的CMC-Na和SA提高了PM凝胶保水性，而只有XG、0.5％的CMC-Na和1.0％的SA提高了SMp凝胶保水性：TGase增大了凝胶的硬度和保水性，非肉蛋白(SPI、EW、WPC)则相反；肌动蛋白(贮藏和不贮藏)均减小了凝胶硬度和保水性，只有16h贮藏处理时，肌动蛋白提高了PM凝胶的保水性。扫描电子显微镜观察凝胶超微结构发现，PM和SMp肌球蛋白在0.2mol·L~(-1)KCl中均呈现丝状三维网络结构，具有粗和长的丝，而在0.6mol·L~(-1)KCl中则为球状颗粒凝聚交联形成的网络，具有更好的多孔性；凝胶在蛋白 兔骨骼肌肌球蛋白热诱导凝胶特性及成胶机制研究 等电点(PH6.0)形成粗糙的结构，多孔性较差，而在PH6.0形成均匀细致的网络，pH 更高则凝胶结构粗糙且多孔性下降;SPP、TPP使得蛋白凝胶网络中交联轴变长，孔洞 直径变大，HMP的影响程度要小于前两者;亲水胶体改变了蛋白凝胶的网络结构模式; TGase能使凝胶结构更均匀细致，而非肉蛋白则相反，使孔洞变大且分布更为不均一; 肌球蛋白和肌动蛋白混合蛋白经16h贮藏后，凝胶结构更细致. 第3章兔骨骼肌肌球蛋白的流变学特性:研究了蛋白浓度、PH值、离子强度、 磷酸盐、肌动蛋白、金属离子对肌球蛋白流变学特性的影响.结果显示:PM和SMp 肌球蛋白的G’、G‘随蛋白浓度增大而增大，同时伴随6的变小，但并不改变相变温 度;两种肌球蛋白相变初始温度均为41 .7℃左右，dG‘/叮显示，第一峰值点43℃， 第二峰值点47℃左右，第三峰值点56℃左右，分别对应着肌球蛋白分子中的L拟h inge region、HMM和L以三个部位;且G‘、G”均在80℃左右有最大值;相位角6变小的 转折点对应着G’、G‘变化曲线的各转折点.PH显著影响了初始相变温度，且在pH6.O 时G’、G’有最大值.离子强度并不改变初始相变温度，但改变了相变过程;低离 子强度(0 .1、0.2)下，G，、俨高于同等温度时高离子强度下的G’、少，而6在 30一40℃间急剧变小.SPP和TPP降低T最大G‘、G‘值，而HMP则提高TG‘、G “值.各种磷酸盐均不同程度地降低了蛋白的初始相变温度，改变了转折点的个数及 温