收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白主要抗原区基因在巴斯德毕赤酵母中的表达和初步应用

徐学清  
【摘要】:猪瘟病毒是对养猪业危害极大的病原之一,对猪瘟抗体水平进行正确监测是防治猪瘟的重要前提,本研究围绕检测猪瘟抗体水平试剂盒的研制开展了如下实验: 1.设计两对引物扩增E2蛋白的A/D抗原区和B/C抗原区基因,并将扩增出的373bp和261bp目的片段分别插入毕赤酵母表达载体p PICZ_αC中,构建成重组质粒pPICZ_α-AD和p PICZ_α-BC,并筛选得到含A/D基因的高拷贝转化子5株,含B/C基因的高拷贝转化子3株,经甲醇诱导表达、SDS—PAGE、间接ELISA和Western blot试验,结果表明:两个基因片段都能被分泌表达,且都含有具有良好反应原性,但A/D区基因表达产物E2AD蛋白结合抗体的能力比B/C区基因表达产物E2BC蛋白高。 2.研究了培养条件与表达产量的关系,确定高拷贝重组酵母表达E2蛋白的最佳条件为:在BMGY中培养至菌体OD_(600)值达3~3.5时,将菌体转入相当于4倍体积BMGY、pH6.0的BMMY培养基中培养72h,每24h加入甲醇使终浓度达0.5%~1.0%。在最佳条件下E2AD蛋白的表达量可达275.38ug/mL,是E2BC蛋白的22.39倍,是A/D区基因原核表达产物E2HA蛋白的35.53%;通过比较不同温度下保存E2AD蛋白的降解率得出酵母培养物上清应保存于-20℃。 3.以E2AD蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪瘟抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法的实验步骤进行了优化,优化后的步骤是:0.688μg/100uL抗原4℃过夜包被后,用1%BSA封闭3h,再与1%BSA稀释的血清作用45min,接着与酶标二抗在37℃作用30min或室温下作用45min,然后用TMB在37℃作用15min或室温下作用20min,最后用0.15%HF终止反应,用此优化方法检测了30份来自发病猪场的待检猪瘟阳性血清样品,并将其与以E2BC蛋白及以E2HA蛋白作为包被抗原的两种间接ELISA方法和兰州兽医所的间接血凝试剂盒方法相比较,发现间接ELISA方法比间接血凝试剂盒方法敏感,以三种不同蛋白建立的间接ELISA方法的敏感性从高到低依次为:E2HA>E2AD>E2BC。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 徐学清,张素芳,郑其升,苏小运,任雪枫,陈溥言;猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因在酵母中的分泌表达与鉴定[J];中国病毒学;2004年06期
2 克水;;他捅了医学界的马蜂窝[J];科学之友;2001年04期
3 王凯;法国在国际科技合作中的知识产权保护[J];科技广场;2003年08期
4 语人;;挫折的魅力[J];少年科学;2003年03期
5 木克水;;他捅了医学界的马蜂窝[J];科学大众(中学版);2001年01期
6 韦宇拓,汪嵘,杜丽琴,陆坚,黄鲲,黄日波;合成耐高温α-淀粉酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达[J];中国生物工程杂志;2005年01期
7 吴明;从微生物学到现代生物工程学——纪念巴斯德逝世100周年[J];百科知识;1995年09期
8 袁佩娜;法国巴斯德霍乱研究所研究工作介绍[J];微生物学免疫学进展;1987年01期
9 吕宗吉,李红卫,涂长春,余兴龙,吴健敏,李月红,殷震;我国部分地区猪瘟病毒流行株的基因差异[J];中国兽医学报;2000年04期
10 孟庆玲,高 丰;猪瘟病毒及其分子流行病学研究进展[J];畜禽业;2001年11期
11 曾铭珠,唐翠英,杜坚,宁宗秋,黄红梅;广西猪瘟病毒的调查研究[J];广西科学;1994年03期
12 章金钢,涂长春,金扩世,李红卫,胡敬东,扈荣良,戴秉丽,殷震;猪瘟病毒反义基因在培养细胞上的效应研究——反义基因对猪瘟病毒的抑制作用[J];生物技术通讯;1995年02期
13 聂玉春,王镇,周海霞,邓宏魁,丁明孝;猪瘟病毒的形态结构及侵染机理的研究[J];电子显微学报;2002年05期
14 李春阳,单松华,华修国;应用RT-PCR技术快速检测鉴定猪瘟病毒[J];上海交通大学学报(农业科学版);2003年01期
15 杨林,赵德明,王秀荣;猪瘟病毒流行株的分离鉴定[J];畜牧兽医科技信息;2005年04期
16 杨林;赵德明;王秀荣;;猪瘟病毒流行株的分离鉴定[J];中国畜牧兽医文摘;2005年05期
17 周廷冲;;路易·巴斯德的一生[J];生命的化学;1982年04期
18 姚祝军,戴立信;生命系统中的立体专一性和分子识别──纪念巴斯德逝世100周年学术讨论会洛克菲勒会议简介[J];世界科学;1995年12期
19 王琴,李博,王在时,丘惠深,郎洪武;猪瘟病毒强弱毒株和野毒株E2全基因序列测定及比较分析[J];微生物学报;2001年03期
20 ;国际病毒生物学研讨会在上海生科院召开[J];生命科学;2005年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 贾洪林;仇华吉;李国新;朱庆虎;李娜;童光志;;猪瘟病毒E~(rns)和E2基因的高效表达与E~(rns)-ELISA鉴别诊断方法的建立[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第六次学术交流会论文集[C];2004年
2 王琴;王在时;李博;丘惠深;郎洪武;;猪瘟病毒强弱毒株和野毒株E2全基因序列测定及比较分析[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年
3 张富强;;猪瘟病毒糖蛋白E~(rns)中和表位的鉴定和比较[A];2004年中国科学院新生病毒性疾病控制学术讨论会摘要集[C];2004年
4 刘思国;涂长春;余兴龙;张茂林;刘伯华;吴健敏;;猪瘟病毒E2蛋白抗原单表位基因的融合表达及其免疫活性的研究[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
5 郑小坚;;猪瘟病毒F114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
6 刘中勇;曾小娜;朱道中;房红莹;蒋启荣;吴志强;罗满林;;猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C];2009年
7 蔺涛;郑浩;韦祖樟;李燕华;姚火春;袁世山;;猪瘟疫苗研究进展[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
8 吕宗吉;涂长春;李红卫;余兴龙;吴健敏;李月红;殷震;;中国猪瘟病毒流行株的基因多态性研究[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(下册)[C];2001年
9 玉琴;宁宜宝;王在时;宋立;赵耘;张广川;范学政;陈振海;秦五明;李博;丘惠深;;猪瘟病毒EO基因的序列分析[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年
10 徐卓菲;司有辉;何雁南;晁彦杰;钱平;陈焕春;;CSFV猪瘟病毒NS3非结构蛋白结构模型的建立[A];2006年度学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭焕成;猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒寡核苷酸芯片的研究与应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
2 张富强;应用噬菌体展示技术进行猪瘟病毒结构(糖)蛋白E2和E~(rns)中和抗原表位鉴定和比较[D];中国人民解放军军需大学;2002年
3 韩雪清;猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究[D];西北农林科技大学;2002年
4 刘堰;重组人白介素-2(IL—2)突变体克隆及在巴斯德毕赤酵母系统中的表达与纯化[D];重庆大学;2002年
5 刘伯华;猪瘟病毒E2基因在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的制备[D];中国人民解放军军需大学;2002年
6 杨林;猪瘟病毒基因芯片诊断技术的研究及应用[D];中国农业大学;2005年
7 吴丽娟;重组人A20的分子设计及酵母表达研究[D];重庆医科大学;2004年
8 吴海祥;CSFV石门株基因组感染性克隆的构建与致细胞病变分子机制研究[D];武汉大学;2003年
9 肖驰;猪繁殖与呼吸道综合征、猪瘟和猪圆环病毒病诊断DNA微阵列的构建及其检测技术研究[D];四川农业大学;2005年
10 孙永科;表达猪瘟病毒石门株E0/E2基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究[D];西北农林科技大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 徐学清;猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白主要抗原区基因在巴斯德毕赤酵母中的表达和初步应用[D];南京农业大学;2004年
2 姜庆;比较猪瘟病毒兔化毒株和石门株5端非编码区对病毒翻译的影响[D];山东师范大学;2011年
3 朱元源;猪瘟病毒结构蛋白与生物学特性的关系[D];中国兽医药品监察所;2010年
4 满朝来;猪瘟病毒HL-LY地方株E2基因在毕赤酵母中的表达及高效表达条件的探索[D];东北农业大学;2003年
5 赵志军;猪瘟病毒E2基因克隆、序列分析及最佳猪瘟免疫程序的制定[D];河北农业大学;2003年
6 朱妍;猪瘟病毒特异性单克隆抗体的研究[D];吉林农业大学;2005年
7 史子学;猪瘟荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D];吉林大学;2006年
8 韦栋平;猪瘟病毒广西流行株E_2基因扩增与反应条件的优化研究[D];广西大学;2001年
9 肖昌;应用随机肽库鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位[D];中国人民解放军军需大学;2002年
10 姚淑瑜;猪瘟病毒E2基因杆状病毒转移载体的构建及病毒诱导细胞凋亡的研究[D];广西大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 甘霖;巴斯德流感疫苗工厂试生产[N];深圳特区报;2010年
2 田雪;美国采购H5N1禽流感疫苗 赛诺菲巴斯德提供新毒株[N];科技日报;2008年
3 ;美国通报与脑膜炎球菌疫苗相关的格林-巴利综合征[N];健康报;2007年
4 任荃;擒拿“首犯”:艾滋病肝炎病毒[N];文汇报;2004年
5 火言;疫苗研发全球赛跑[N];中国质量报;2003年
6 李兴华;赛诺菲巴斯德流感疫苗项目挂牌[N];深圳特区报;2008年
7 记者 陈莺;人用疫苗生产企业积极参与[N];民营经济报;2005年
8 驻京记者 王丹;流脑疫苗市场升温[N];医药经济报;2008年
9 曾 昀;三大巨头争夺我国流感疫苗市场[N];中国国门时报;2004年
10 筱雯;摩洛哥巴斯德研究所发现与隐睾相关基因三个新突变[N];中国医药报;2007年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978