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中华鳖核黄素受体基因的克隆和在转基因植物中的表达

王颖  
【摘要】:核黄素在生物体内形成黄素单核苷酸FMN及黄素腺嘌呤二核苷酸FAD,它们是黄素酶的辅酶。核黄素所形成的辅酶参与机体组织维生素C抗氧化作用的呼吸电子传递及氧化还原过程,参与植物抗氧化及过氧化过程,从而影响氧化性损伤及后续过敏反应过程中活性氧中间体(ROIs)的产生,而ROIs是过敏细胞坏死的重要信号,能调节生长、抗病、抗虫、抗逆,所以核黄素与植物免疫反应有关。外施核黄素可以诱导植物抗病性。植物中的核黄素水平可能对抗病防卫和生长发育过程有影响。因此,如果能够控制核黄素水平就能相应控制这些重要过程,提高植物抗病防卫的能力并促进植物生长发育。我们可以以此为切入点研究核黄素参与的植物防卫和生长调控的交叉点。 核黄素受体或结合蛋白可能作为动物机体中维生素的储存机构。在本研究中,作者克隆了中华鳖的核黄素受体基因(RfBP),用它转化拟南芥和烟草,并获得转基因植株;这样可以根据核黄素受体对核黄素浓度的调节作用或二者特异结合可能引发的反应,研究核黄素在植物抗病防卫和生长信号传导中的作用。 作者根据已知的鸡核黄素受体与海龟核黄素受体的同源性设计引物,用PCR方法首次从中华鳖中克隆到了核黄素受体基因,经测序证明与鸡和海龟中的核黄素受体基因同源性都很高,将其连接到了植物表达载体pBI121上,pBI121的T区含有两个转录单元:一个为nos启动子,卡那霉素抗性基因NPTⅡ和nos终止子;另一个为椰菜花叶病毒35S启动子、GUS基因和nos终止子。测序证明构建好的质粒序列是正确的,然后在农杆菌的介导下,分别通过花序真空渗透法和Horsch叶盘法将该含核黄素受体的质粒转化到了拟南芥和烟草上。根据pBI121上携带的卡那霉素抗性基因对得到的转基因植株种子进行初筛,筛选到了转基因植物结合分子检测方法得到了T1代到T3代植株。通过PCR和Southern杂交方法证明核黄素受体RfBP基因已经整合到了植物染色体上,RT-PCR和northern杂交证明了转化的核黄素受体RfBP基因在转基因植物中能够高效表达。 由于启动SA、JA和乙烯信号通路的激发子均可刺激核黄素合成基因表达,使核黄素含量提高,同时它们与核黄素一样均诱导对细菌的抗性,因此核黄素在组织内含 中华鳖核黄素受体基因的克隆和在转基因植物中的表达 量变化可能影响杭病防卫基本信号通路。通过荧光法分析转双厂召尸基因拟南芥植株的 核黄素含量,发现转凡田尸基因植株的核黄素含量与转空载体对照植株相比明显降低。 用核黄素处理植株,转空载体植株的核黄素含量在6,J、时后达到最高,随后就一直下 降。而转双胆尸基因植株的核黄素含量在6,J·时增高,12小时有所下降,却在24小 时达到最高值。此结果显示药旧尸基因表达的核黄素受体在拟南芥体内与核黄素结合, 并调节了核黄素含量的变化。同时,观测表明,表达乃心尸的转基因拟南芥植株发生 株高、叶色、株型、花序数等多种生长表型改变。这些结果为研究核黄素含量对植物 抗病防卫和生长发育信号传导的调控提供了依据。


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