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猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及初步应用

陈德  
【摘要】:1.建立了一种同时检测PCV2、PPV和PRV的多重PCR方法。根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV基因序列,针对各自保守区各设一对特异性引物,用这三对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV进行检测,结果同时扩增出了1030bp(PCV2)、582bp(PPV)和372bp(PRV)三务特异性片段。对其它几种病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR技术能检出PCV20.1pg、PPV10~(-3.5)个TCID50和PRV10~(-4.6)个TCID50病毒含量的模板。该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。 2.根据GenBank上发表的PRV TK、gE和gB基因核苷酸序列,针对各自保守区分别设计三对特异性引物,扩增出了PRV的TK、gE和gB三条特异性片段,长度分别为277bp、144bp和372bp,对其它几种病原的PCR扩增结果均为阴性。用这三对引物组装TK、gB和gE、gB两套试剂盒,对检测样品中的PRV进行检测;敏感性测定结果表明,该多重PCR技术能检出PRV的TK、gE和gB分别为10~(-4.6)个TCID50、10~(-3.6)个TCID50、10~(-4.6)个TCID50的病毒含量的模板。同时我们对试剂盒进行了DNA提取方法、组成成分和反应条件的优化及试剂盒重复性和保存期等实验。该诊断试剂盒的建立对临床上进行PRV强弱毒的鉴别诊断和进行伪狂犬病的扑灭计划具有重要意义。 3.自2002年4月份以来对安徽、江苏、江西、山东、湖北、上海等地17个集约化养猪场,进行了猪圆环病毒2型(PCV2)感染的流行病学调查。此次调查,我们运用PCR方法,调查范围主要为断奶仔猪多功能衰竭综合征疑似发病猪场及正常猪群不同年龄阶段的猪。结果疑似猪群中,PCV2检出率为60.6%(43/71),屠宰猪群的阳性率仅为6.7%(1/30),而初生仔猪(2~3日龄)的阳性率亦可达42.9%(15/35)。表明我国猪群中普遍存在PCV2的感染。 4.根据Genbank发表的PCV2全基因序列,针对保守序列,设计两对扩增全基因序 中文摘要 列的引物,从检测为猪圆环病毒2型的阳性病料中,挑选不同年龄段感染猪的3 份PCR检测为PCVZ阳性的病料分别接种PK一15细胞,盲传6代后,用PcR鉴定 PK一15细胞上PCVZ复制增殖情况.结果表明,从3株PK一15细胞中均扩增出了 1030bp的PCvZ特异条带,将分离的3株PCvZ分别命名为PCV-SHO、PCV-JS和 PCV-SHM.进行全基因扩增,三个分离株基因组大小均为1 767bp.应用DNAstar 序列分析软件,对测定的3个PcvZ分离株全基因组序列与Genbank中的国内外 Pcv毒株进行同源性比较并绘制系统发生树,3个PcvZ分离株与世界上其它地区 的PCvZ分离株密切相关,核普酸序列同源性达94.5%一10。%.另外,不同PcvZ 毒株之间基因组核普酸序列相对比较保守,但来源于不同地区的PCvZ分离株基 因组序列存在明显差异. 5.柱层析后得到较纯的猪IgG,免疚BALB/C小鼠,进行细胞融合,经过酶联免疫 吸附试验(ELISA)筛选,得到两株能稳定分泌杭猪IgG的单克隆抗体(以下称单 抗),分别命名为IA:0B;和3BI,E2.测定单杭腹水的ELIS^效价,IA,。B;和3B,,EZ 的效价分别为1:2 000和1:4000.免疚印迹试验结果表明,两株单杭均识别IgG 重链(分子量约为60KD).将单抗分别与牛、羊、马和鸡等畜禽类血清包被的醉 标板作间接ELISA,结果表明单杭只与猪血清的蛋白发生特异性反应,而不与其 它畜禽类血清的蛋白反应.这说明抗猪IgG单杭具有较好的特异性.


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