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稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)致病相关基因的分子标记及克隆

刘娟  
【摘要】: 利用近年来发展起来的真菌限制性内切酶介导整合(REMI)插入诱变技术,用含有HygB抗性标记的质粒pUCATPH在稻瘟病菌菌株M131中建立一个转化体系,结果发现用不同的限制酶介导转化,原生质体的转化效率有不同程度的提高,经过多次转化得到639个转化子,对其中的200个转化子进行致病性测定,发现其中6个转化子对一些品种的致病性和原始菌株M131对比发生了变化,即为致病性突变体,同时还观察到部分表型发生变化的表型突变体。 用DIG辛标记质粒pUCATPH作为探针对6个致病性突变菌株和两个表型突变菌株进行点杂交检测,结果都呈杂交阳性,说明质粒的插入使原始菌株M131的某个致病相关基因或黑色素产生相关基因发生了突变。对这些突变菌株进行rep-PCR分析,发现变菌株的rep-PCR图谱不仅和原始菌株M131相比有一定差异而且相互间也有区别,可以认为这些菌株在分子水平上发生了突变,并且在REMI诱变中质粒插入基因组的位点不同。将其中两个表型突变菌株及rep-PCR图谱差异性较大的两个致病性突变菌株和M131的DNA分别用Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切电泳后,以DIG辛标记的质粒为探针进行RFLP分析,结果发现突变菌株中不仅在质粒插入位点有杂交信号,而且在分子量较小处也有强弱不一的信号出现。这些现象可能是质粒多位点串联整合并且整合后发生重组的结果。 突变菌株01-36对已知含有抗病基因Pita的K1品种致病性发现了变化,根据基因-基因学说,可以推测菌株中无毒基因avr-Pita可能发生了突变。依据已经发表的无毒基因avr-Pita序列设计出引物P1、P2,分别对M131和突变菌株01-36基因组DNA进行PCR扩增,结果都出现一条1100bp左右的扩增带。将M131的扩增片段测序后得到长度为1057bp的序列,并且将所测序列和已知的avr-Pita一段序列比较发现达98%的同源,即该序列为无毒基因的某一段序列,但插入的位点并不在所扩增片段内。另外选取一些来自不同地区的致病性差异较大的稻瘟病菌菌株进行PCR扩增,以M131扩增产物为探针,对各扩增产物进行点杂交分析,结果都为阳性反应,即所有扩增片段都可能和无毒基因avr-Pita有部分同源性。本文通过无毒基因的克隆和分析,对基因-基因学说中病原菌无毒基因和抗病基因互作方式进行了初步探讨。


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