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棉铃虫对Bt毒素—Cry1Ac抗性的生化及分子机理研究

许新军  
【摘要】:转基因Bt棉对棉铃虫具有很好的杀虫效果,其种植面积占我国棉花总面积的三分之二。但是棉铃虫对Bt棉的抗性将直接影响Bt棉的使用寿命。棉铃虫对Bt毒素抗性机理的阐明将有助于从分子水平上找到可靠的检测方法,从而能准确监测棉铃虫对Bt棉的抗性发展,为制定合理的抗性治理措施以延长Bt棉的使用寿命提供依据。 一、棉铃虫对Cry1Ac毒素抗性品系筛选 在实验室内用活化的Cry1Ac毒素对2001年采自河北高阳的棉铃虫进行了28代的连续筛选,获得了GYBT抗性品系,该抗性品系对Cry1Ac的抗性水平高达800倍以上。2002年对采自全国10个县市的三、四代田间棉铃虫种群进行了抗性水平的监测,结果表明棉铃虫不同地理种群对活化的Cry1Ac毒素的敏感性差异较大。 二、棉铃虫中肠蛋白酶活性测定、酶谱及降解毒素分析 分别用类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、氨肽酶及总蛋白酶的专性底物比较了抗性和敏感棉铃虫中肠的蛋白酶活性。结果表明类胰蛋白酶及氨肽酶对底物的活性及亲合力在抗性和敏感品系间没有明显差异;而GYBT抗性品系的类胰凝乳蛋白酶活性低于敏感品系,但GYBT品系的总蛋白酶活性却高于敏感品系,类胰凝乳蛋白酶及总蛋白酶对底物亲合力的变化与之相反。TLCK,TPCK及PMSF三种蛋白酶抑制剂对中肠蛋白酶的活性抑制测定表明:抗性品系中肠内的类胰凝乳蛋白酶及总蛋白酶的抑制率明显低于敏感品系。在棉铃虫中肠蛋白酶的变性及非变性酶谱分析中,抗性品系中肠蛋白酶的结构组成不同于敏感品系——产生了一条新的蛋白酶。在离体条件下用抗性和敏感品系中肠蛋白酶液对Cry1Ac进行降解,结果表明蛋白酶对毒素的降解作用在抗性和敏感品系之间没有明显的不同。因此,GYBT抗性品系棉铃虫中肠蛋白酶结构组成发生了一些改变,但只是棉铃虫对外源食物的一种适应,而不是导致抗性的主要因素。 三、棉铃虫Cadherin类受体基因克隆及抗性遗传连锁分析 采用PCR及3’RACE技术,分别从棉铃虫敏感(GY)和抗性品系(GYBT)


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