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致病性嗜水气单胞菌的检测与一种温敏胞外蛋白酶基因的克隆、表达及其免疫性研究

任燕  
【摘要】:在鱼类致病性气单胞菌诊断试剂盒的基础上,用Dot-ELISA检测致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)胞外蛋白酶,同时扩增Ah的16S rDNA和aer基因。脱脂奶平板法、Dot-ELISA与PCR扩增检测72株分离株,Dot-ELISA、脱脂奶平板法、aer基因扩增和16S rDNA扩增检测的阳性率分为90.3%(65/72)、75%(54/72)、94.4%(68/72)、81.9%(59/72)。Dot-ELISA与脱脂奶平板法两者符合率为79.2%(57/72),与aer基因扩增的符合率为91.6%(66/72),与16S rDNA扩增的符合率为81.9%(59/72)。Dot-ELISA试验用批内、批外的试剂盒重复3次结果一致。这表明Dot-ELISA检测具有敏感、特异、实用的特点,可用于鱼类致病性Ah的临床诊断。 根据已发表的人源Ah温敏胞外蛋白酶基因eprAl的核甘酸序列,设计合成一对引物,以Ah J-1基因组DNA为摸板,通过PCR扩增得到1005bD的温敏胞外蛋白酶基因eprCAI,从第90个碱基开始编码蛋白质,有305个氨基酸。将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体pMD-eprCAI。序列分析发现与发表的Ah AH1的胞外蛋白酶eprAl基因的同源性有91%,有较高的抗原性。根据测序结果重新设计一对引物,检测21株Ah。建立检测Ah eprCAI的PCR方法。检测灵敏度可达1.5×10~(-3)g/L的模板DNA。 根据eprCAI基因测序结果,在其ORF阅读框内设计编码成熟蛋白的引物进行PCR扩增。得到850bp目的产物,经EcoRI+SalI双酶切后以正确阅读框架定向克隆于经同样双酶切的pET-32a(+)中,转化表达宿主菌BL21。该菌株经IPTG诱导可表达分子量约53.2kD的特异蛋白,占菌体总蛋白的42%。在30℃和37℃诱导分别产生以可溶性和包涵体为主的特异蛋白。诱导后,重组菌冻融液在脱脂奶平板上经28℃24h孵育可见透明的溶蛋白圈,即有蛋白酶活性,而经56℃30min处理后则无溶蛋白圈出现。免疫转印显示Ah J-1胞外产物的抗血清可以识别该融合蛋白,表明该重组蛋白具备天然蛋白的抗原性,但Ah J-1的胞外金属蛋白酶ECPase54抗血清不能识别该融合蛋白。用50LD_(50)的Ah J-1菌体(10~7CFU)及过滤除菌后的培养上清,分别腹腔注射免疫后的小鼠,则融合蛋白的相对保护率均为60%。


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