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两株H5N1亚型禽流感病毒诱导的细胞凋亡研究

余丹丹  
【摘要】:禽流感病毒以感染禽类引起大爆发和急性死亡为特征,但近年来,禽流感病毒已经能够跨越种间屏障直接感染人了。研究病毒-宿主相互作用对于阐明病毒引起疾病的机理起到至关重要的作用。流感病毒诱导的细胞凋亡,涉及到各方面的问题,包括细胞和病毒因子的相互关系、细胞种类等因素。对于禽流感病毒感染诱导的细胞凋亡作用既可能是有利于病毒的扩散,也可能是机体对病毒感染的防御反应。本研究目的是在了解禽流感病毒的NSl基因引起细胞凋亡的基础上,进一步探索全病毒对鸡胚成纤维细胞以及哺乳动物的作用,为阐明禽流感病毒的致病机理提供理论依据。 实验中我们选择了生物学特性差异明显A/Duck/Guangdon/40/2000(H5N1)(简称DKGD/40/00)和A/Duck/Guangxi/35/2001(H5N1) (简称DKGX/35/01)两株H5N1亚型禽流感病毒来进行实验,DKGD/40/00和DKGX/35/01同属于H5N1亚型禽流感病毒,对于禽类是高致病性的,而在小鼠上,DKGD/40/00是感染不致死,DKGX/35/01是感染且致死小鼠。我们把这两株病毒的NS1基因进行了克隆,应用荧光显微镜检测构建于真核表达载体pIRES2-EGFP的NS1蛋白的转染表达效率及瞬时表达,应用TUNEL和流式细胞仪观察NS1蛋白与凋亡的关系。结果表明:两株病毒NS1蛋白表达均能诱导Hela细胞凋亡,凋亡率最高可达15.29%,但是两者间并无明显差异。由此说明单一的NS1并不能完全阐明凋亡的产生与病毒毒力强弱和病毒扩散之间的关系。 在了解禽流感病毒的NS1基因引起细胞凋亡的基础上,我们研究了这两株病毒对鸡胚成纤维细胞的凋亡作用,结果发现经过病毒诱导后,细胞出现生长特性及细胞形态学的改变,DNA电泳出现典型梯状条带;流式细胞仪显示凋亡峰出现,凋亡率最高可达23.64%,且两种病毒诱导的细胞凋亡差异极显著,DKGX/35/01诱导的细胞凋亡率明显高于DKGD/40/00。结论:H5N1亚型禽流感病毒可诱导体外培养鸡胚成纤维细胞发生凋亡,且跟病毒的毒力有关。 1997年香港H5N1禽流感病毒感染人事件发生表明禽流感病毒正在获得感染人的能力,在分子水平及其细胞水平的研究基础上,为了了解禽流感病毒对哺乳动物的致病机理与细胞凋亡的关系,我们用两株H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染BALB/C小鼠后,采集心、肝、脾、肺、肾、脑和胰等器官,用免疫组织化学的方法检测了病毒抗原的位置;同时,还应用TUNEL方法来检测这些组织中的凋亡信号。结果表明,


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