多枝赖草（Leymus multicaulis）盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析

【摘要】：多枝赖草(Leymus mul ticaulis＜Kar1 Kir1＞Tzvel 1，2n=4X=28，XmXmNsNs)属于小麦近缘属赖草属，分布于欧亚地区不同的生态环境下，我国主要分布于新疆地区，生长于平原绿洲和盐渍化荒漠草甸，具有突出的耐瘠薄、耐盐碱性、耐寒性等特性。开展多枝赖草抗逆分子生物学研究，分离耐盐相关基因，对于农作物的耐盐育种具有重要意义。本研究以盐胁迫下的多枝赖草叶片为材料，改良了多枝赖草叶片总RNA提取方法，建立了适合多枝赖草的mRNA差异显示体系，分离与分析耐盐相关基因cDNA序列，克隆谷胱甘肽还原酶基因。结果如下： 采用四种方法提取多枝赖草叶片总RNA(异硫氰酸胍法、SDS法、CTAB法和TRIZOL试剂快速提取法)，结果表明：TRIZOL提取法提取的RNA产量较低，电泳呈现出28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA三条清晰的条带，A_(260)／A_(280)为1.845，A_(260)／A_(230)为2.091，表明RNA的纯度很高。而另外三种方法获得的RNA纯度低，有降解现象。用TRIZOL法提取的RNA作为模板，可以扩增出组成型Actin基因片段，表明提取的多枝赖草叶片总RNA能够满足分子生物学研究需要。 通过对退火温度、模板用量、Taq酶和Mg~(2+)浓度的优化，建立了适合多枝赖草基因差异显示的DDRT-PCR体系。选用26个随机引物，分别与3个锚定引物组合成引物对，进行盐胁迫下多枝赖草mRNA差异显示，获得17个长度在300～600bp的差异cDNA条带，进行序列测定及分析。反Northern杂交分析筛选出11个阳性片段。 GenBank／BLAST分析，DNA片段1编码的蛋白与腺苷酸结合蛋白有29％的相似，这与DNA的表达调节有关；cDNA片段2编码的蛋白质与与UMP／CMP kinase 42％相似，UMP／CMP kinase与核苷酸的磷酸化有关，在信号传导方面起作用cDNA片段4编码的蛋白质与S9蛋白有49％的相似性，S9蛋白具有清除活性氧的功能，而活性氧是各种水分胁迫的主要伤害